茶白星病不同病情等级下叶际细菌群落多样性与功能预测

周凌云，向 芬，刘红艳，李 维，周 琳，银 霞，曾泽萱，王振中

（1.湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125；2.华南农业大学 农学院，广东 广州 510642）

茶白星病属于高海拔茶区常发叶部病害之一。该病一般在春茶萌芽初始发生，最初在茶园的嫩芽及嫩叶上出现针头大褐色小点，后逐渐扩大成直径0.3～2.0 mm的圆形病斑。整个茶园叶片上布满红褐色圆形斑点，病斑后期直径最大至2.0 mm、病缘紫黑色、中央灰白色形似鸟眼状。茶白星病发病高峰期与春茶采摘期基本一致，而且春季相对降雨量较大，不利于茶白星病的化学防控[1]。病害发生与环境、寄主关系密切，高海拔茶区的叶际微生物环境是病害发生的重要影响因素，茶白星病的发生程度与环境各项因子均有相关性[2-3]。在微观茶叶表面往往有茶叶自身分泌的儿茶酚等对多种病原菌有抑制作用的物质，抑制真菌孢子萌发，甚至导致孢子破裂[4]。

叶际作为茶树主要微生物栖息地，叶际微生物之间的互作影响植株的健康与生长，以及农作物的产量[5-6]。目前叶际群落的研究主要集中在可培养的物种或者病原菌以及与植物寄主互作相关的有益微生物上[7-8]。然而，目前自然环境中只有少数微生物可以被人工培养。由于高通量测序技术不再局限于可培养微生物的研究，因此近年来高通量测序技术的发展促进了拟南芥[9]、水稻[10]和菠菜[11-12]等作物叶际微生物组成和结构的深入研究。尤其在环境[13-15]、基因型[16]、海拔[17]、季节[18]等生物和非生物因素共同调控植物叶际微生物的群落结构。茶叶根际土壤微生物通过16 SrRNA、PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE），明确其最大影响因子为土壤PH值[19]与液体[20]。在农业生态系统中很少有运用高通量测序技术研究作物—叶际生物—病原菌相互作用的报导，目前开始逐渐应用这种高通量测序测定的微生物群落来分析生物胁迫情况[6]，如测序显示南瓜白粉病菌改变了南瓜叶际细菌群落结构，影响细菌群落多样性[21]。

本文通过Miseq 2×3006p宏基因组测序平台扩增3个茶白星病病情等级下细菌的V3～V4区，全面评估茶白星病引致的叶际细菌群落多样性及类群组成，筛选出与茶白星病发生相关的细菌，比较分析叶际微生物和病原菌的相互作用，以期为茶白星病的生物防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和采样地点

供试样品采自湖南石门县东山峰茶叶基地的福鼎大白茶，采集时间为2018年4月25日下午，正值茶白星病田间发生病情上升期间。试验根据茶白星病斑面积占整个叶面积比例设为3个处理，每个处理分别对应一个病情等级。BCK：无病斑（空白对照）；B2：2级，病斑面积占整个叶面积的11%～50%；B4：4级，病斑面积占整个叶面积的80%以上。根据发病程度各采集3张叶片。

1.2 DNA提取、扩增和测序

称取6 g叶片于100 mL的磷酸缓冲溶液（pH7.0，0.1 mol/L）中，再加入100 uL吐温80。超声波震荡8 min后在25℃条件下以200 r/min的转速在摇床中震荡30 min，接着用超声波震荡2 min。使用0.45 μm滤膜收集细菌，采取液氮研磨的方法将样品磨成粉末状，应用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根）抽提DNA。以此DNA为模板，并应用16SrRNA基因的通用341F引物CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG及805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCA[22]对样品进行PCR扩增。50 μLPCR反应体系：5 μL10×PCRbuffer（ 含20 mMMgC12），1.5 μLdNTP（10 mM），1 UTaqDNA聚合酶，1 uLDNA模板，加灭菌ddH2O补至50 μL。PCR反应程序：94℃预变性1 min；94℃变性20 s，56℃退火25 s，72℃延伸40 s；循环35次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR扩增产物用l.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，纯化后送公司进行高通量测序。

1.3 序列数据处理与统计分析

首先使用FastQC评估原始数据的质量指标，去除未识别碱基和低质量序列。计算DNA矩阵，调用UPARSE程序，在最佳的similarity值下对序列进行 OTU （Operational Taxonomic Units）分类单元划分。应用VENN图可以用来统计样本中共有的和独有的OTU数目，再使用非加权组平均法UPGMA （Unweighted pair group method with arithmetic mean） 算法构建树状结构，同时基于各样本物种丰度通过Bray-Curtis算法构建的样本聚类树与物种丰度柱状图结合起来，RDP-Classifer软件分析设置置信度参数为50%。对数据进行均一化处理，计算不同分类等级上的OTU的数量和Chaol，绘制稀释曲线。使用去趋势对应分析（Detrended Correspondence Analsis，DCA）以及非参数检验方法Adonis来分析不同等级之间的细菌群落结构差异。并基于PICRUSt功能二级分类结果，比较样本或组间丰度差异，找出样本丰度存在差异的功能分类，默认筛选条件为P≤0.05。

2 结果与分析

2.1 茶叶叶际细菌群落基本组成和结构

原始数据经过处理后共获得111335条高质量序列片段，平均为37112条，见表1；在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，见图1。其中检测到1925个OTUs，随着病情等级提高，OTU的相对丰度与病情等级呈正相关。BCK、B2和B4中特异OTU分别占33.75%、53.32%和59.29%，所有的样品中共检测到166个重合OTUs，占所有样品OTU总数的8.62%；BCK、B2和B4中独有OTU分别占14.95%、20.20%和27.21%（图2）。在所有样品中共鉴定到细菌36个门、56个纲、81个目和175个科、438个属。在门的水平上，占优势的门到属依次为Proteobacteria（变形菌门）、Alphaproteobacteria（变形菌纲）、Sphingomonadales （鞘脂单胞菌目）、Sphingomonadaceae（鞘脂单胞菌科）和Sphingomonas（鞘脂单胞菌属），分别占OTUs的 83.09%、53.96%、31.13%、31.62% 和30.62%（图1）。通过计算不同分类水平上鉴定出来的种系型，不同发病程度的细菌种类主要分布在Proteobacteria （变形菌门），优势纲则为 Alphaproteobacteria与 Betaproteobacteria（B-变形菌）。在属的水平上，它们在不同的病情等级上具有不同的相对丰度，表生细菌优势菌为Sphingomonas（鞘脂单胞菌属）与Ralstonia（雷氏菌属）。

2.2 发病程度对叶片细菌的影响

本研究对比了3种不同病情等级下细菌群落组成的差异。运用Beta多样性指标来比较多组样品之间的差异，结果表明，细菌群落在3个不同病情等级上具有差异。虽然随着发病病情指数增加而增加，叶际细菌丰度逐渐增加，说明病情越重，独特的OTU含量最高，群落结构最为复杂，健康叶片的OTU特异性最低，群落结构相对单一。图4分析显示相对含量最多的三个属Sphingomonas、Ralstonia与Stenotrophomonas，在B2与B4中菌类逐渐减少，而增幅明显的两种菌则为Methylobacterium与Hymenobacter，B4菌类最多，其中独有的分别有 Ethanoligenens、Taibaiella、Rubinisphaera、Microbacter与Phaselicystis，此结果与VENN图2结果保持一致。

表1 不同病情指数样品OTU统计表Table 1 OTU statistics samples from samples with different severities

表2 样品OTU基本情况统计表Table 2 Basic OTU Statistics of Samples

图1 OTU数目与聚类similarity值关系图Fig.1 Relation between OTU Number and Cluster Similarity Value

图2 不同病情指数样品OTU韦恩图Fig.2 Venn diagram illustrating the number of OTUs from samples with different severities

图3 genus水平上所有样本聚类树Fig.3 Cluster Tree of All Samples at Genus Level

图4 genus水平所有样本群落结构分布Fig.4 Distribution of community structure in all samples at genus level

Alpha 多样性（Alpha Diversity）所指的是单个样品中菌群多样性的分析，是由样品中的物种组成的丰富度（Richness）和均匀度（Evenness）这两个因素组成，一般以Chao1和Shannon 等指数来评估某个样本的菌群多样性，指数越高，说明样本的多样性越复杂。不同样本的alpha多样性分析指数统计（表3）结果显示细菌多样性B4＞BCK＞B2。表明发病程度的不同能够影响细菌的群落组成和结构。

应用多样性距离矩阵归类分析发现，茶白星病显症的B2、B4的OTU在丰度上聚为一类，而CK单独一类（图3）。在门的水平上研究，Proteobacteria与Firmicutes一直下降，而Bacteroidetes与Acidobacteria则上升；而在属水平上，Ralstonia与Stenotrophomonas下降，Methylobacterium与Hymenobacter则随着病情等级提高而逐渐升高，Methylobacterium在Bck、B2、B4中相对丰度分别为0.58%、11.40%和15.05%，而Hymenobacter相对丰度分别为0.54%、6.60%和9.63%（表4）。

2.3 不同病情等级下细菌功能预测

从16 s测序获得的物种构成推测样本中的功能基因构成，通过Bray-Curtis算法构建的样本聚类树与功能丰度柱状图结合起来，发现B4与B2相似性较大，其中菌类组成相比对照依次增加（图5）。P值检验的两两差异统计功能预测如表5，表明随着茶白星病病情严重，其中较大功能变化的编码功能主要为细胞壁生物发生、脂质运输和代谢、辅酶运输和代谢、碳水化合物的运输和代谢等。但其中在B4功能预测中增幅较大的为细胞活力与次生代谢物的生物合成。蛋白质转换及细胞运动等 RNA加工和修饰、胞外细胞内运输、分泌和囊泡运输、防御机制、运输、分解代谢、翻译后修饰、辅酶运输、代谢与翻译及核糖体结构和生物发生的功能被预测，则随着茶白星病发病严重而减少。

表3 不同病情等级样品的alpha多样性指数统计表Table 3 Alpha diversity index statistics from samples with different disease severties

表4 不同病情等级样品在门与属中的相对丰度表（%）Table 4 Relative abundance tables of samples of different disease grades in phylum and genus（%）

图5 基于COG的所有样品聚类树与柱状图组合分析图Fig.5 Combination analysis of clustering tree and histogram for all samples based on COG

表5 差异比较结果功能预测表Table 5 Functional prediction of difference comparison results

3 结论与讨论

细菌是地球上丰富且多样化的物种，目前人们对茶园根际微生物区系已有基本的了解。虽然叶际作为植物上主要的细菌栖息地，为细菌的定殖提供了良好的生活环境，在保护寄主植物免受病原菌侵染方面也具有至关重要的作用，叶际细菌正逐渐被人们所关注，但对茶树地上部分微生物区系的系统研究尚刚起步，有限的研究表明茶园叶面微生物主要是真菌和细菌。细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Curtobacterium）、节细菌属（Arthrobacter）、黄单杆孢菌属（Xanthomonas）、红球菌属（Rhodococcus）、假单孢杆菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavubacteria）、棒状杆菌属（Coryhebacterium）、微球菌属（Microccocus）和红螺菌属（Rhodospirillum）等[23]，

本研究运用宏基因组细菌分类测序对3个不同病情等级下的细菌检测，结果表明Acidobacteria（酸杆菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）在3个病情等级下均为优势门类，且均为优势低温纤维素降解菌[24-25]。Proteobacteria（变形菌门）为绝对优势菌门，占总数的73.53%～90.25%，也是其他植物叶际优势的细菌门类[26-27]。Acidobacteria（酸杆菌门）与Bacteroidetes（拟杆菌门）相对丰度与多样性的变化趋势一致，呈正相关。Methylobacterium（甲醇杆菌属）与Hymenobacter（膜杆菌属）的相对丰度与病情指数正相关。其中Methylobacterium以甲醇为唯一碳源的菌类，因而具有降乙酰甲胺磷[28]等功效，并对部分细菌与真菌具有抗性[29]。而主要来自山地[16]和冻土[17]的Hymenobacter菌类，适应相对低温环境，它们可能与致病菌存在协同作用。而Ralstonia（雷氏菌属）与Stenotrophomonas（寡养单胞菌）丰度出现下降，Ralstonia与Stenotrophomonas是引起植物青枯与腐烂的病原菌属[30-31]。茶白星病病情升高，叶际环境中致病菌的丰度下降的测定结果与高海拔茶区茶白星病严重发生并抑制其它病害的特点相符。

细菌中致病菌不仅影响植物健康，也影响植物相关细菌的组成和结构。OTU差异分析发现3个不同病情等级下细菌群落组成存在差异，表明茶白星病致病菌不仅影响植物健康，也影响茶叶叶际中细菌的组成和结构。细菌群落多样性随着病情的提高逐渐升高，细菌之间的互作高度复杂，单个病原体或有益细菌的丰度变化都可能导致整个细菌组成的改变，推测可能因为茶白星病是一种真菌病害，主要抑制真菌群落。通过对宏基因组测序数据功能比较分析发现防御机制著提升，表明细菌群落在茶白星病发病进程中起一定的效应，但具体的反应模式还有待进一步研究。