赪桐根4个极性部位抗炎活性的比较

唐云丽， 刘君君， 潘翠柳， 秦祖杰， 丘 琴， 欧和生

（广西中医药大学中药药理学重点实验室，广西中医药大学附属国际壮医医院，广西壮瑤药工程技术研究中心，广西南宁530020）

赪桐根为马鞭草科大青属植物赪桐Clerodendrum japonicum（Thunb.）Sweet的根，又名红苓蔃、荷苞花、百日红［1］、 棵朋必劳［2］、 “个朋被”［3］（广西壮族语）， 为广西常用壮药［4-5］，其味甘，性凉，具清肺热、利小便、凉血止血功效，主治肺热咳嗽、热淋小便不利、咳血、风湿骨痛［6］等。

炎症是多种疾病的共同过程，其发生发展与骨质疏松［7］、 糖 尿 病［8］、 心 血 管 系 统 疾 病［9］、 阿 尔 茨 海 默病［10-11］、 癫痫［12］、 癌症密切相关［13-14］， 而一些具有良好抗炎作用的中草药 （民族药）可能通过调节炎症相关因子来对这些疾病产生较好的预防和治疗作用。赪桐根为广西常用民族药，以其为君药组成的赪银合剂对风热型急性扁桃体炎有较好疗效［15］，课题组前期研究证明，其水提物对急、慢性炎症均具有明显作用［16］，并且其醇提物也具有相应活性，但具体部位及机制目前尚不明确。因此，本实验比较赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位抗炎活性，以期筛选出有效部位，进一步明确活性成分，阐明其可能作用机制，为该药材深度开发和临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 药材 赪桐根采自武鸣区高峰林场，经广西中医药大学滕建北副教授鉴定为马鞭草科大青属植物赪桐Clerodendrum japonicum （Thunb.） Sweet的根。

1.2 试药 醋酸地塞米松 （浙江仙琚制药股份有限公司，批号150116，0.75 mg）；头孢克肟分散片 （浙江莎普爱思药业股份有限公司，批号160151E，50 mg）。二甲苯 （批号 F20110613，500 mL）、冰醋酸 （批号 T20110913，500 mL）、伊文思蓝 （批号Lot.No.20140723，10 g） （国药集团化学试剂有限公司）；角叉菜胶 （上海源叶生物科技有限公司，批号YY13755，100 g）；水合氯醛 （成都市科龙化工试剂厂，批号2016020101，250 g）。

1.3 仪器 SQP电子天平 ［赛多利斯科学仪器 （北京）有限公司］；UV-1780紫外可见分光光度计 ［岛津仪器（苏州）有限公司］；TGL-16G离心机 （上海安亭科学仪器厂）；YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器 （上海迅博实业有限公司医疗设备厂）；BP211D光栅型多功能酶标仪 （瑞士Tecan公司）；LRH-250-S恒温恒湿培养箱 （韶关市泰宏医疗器械有限公司）。

1.4 动物 清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g；清洁级SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（桂）2014-0002，实验前适应性饲养3 d。

2 方法

2.1 极性部位制备 取赪桐根粗粉3 kg，加75%乙醇回流提取3次，分别提取2、1.5、1 h，溶剂用量分别为10、8、6倍，过滤，合并滤液，减压浓缩后置水浴锅上挥干溶剂，称定质量，计算得膏率。总浸膏用75%乙醇溶解后，硅胶按1∶1比例拌样，置于回流装置中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇回流提取，回收溶剂，减压浓缩后分别得到石油醚部位19.6 g、乙酸乙酯部位31.7 g、正丁醇部位115.5 g、95%乙醇部位391.5 g，各部位浸膏用0.2%吐温80溶解，分别配制成高、中、低质量浓度溶液。

2.2 活性部位筛选及抗炎作用研究

2.2.1 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响［16-17］取小鼠196只，按体质量随机分为模型组、阳性对照组 （地塞米松0.005 g／kg）及赪桐根各极性部位高、中、低剂量组（40、20、10 g／kg）， 每组 14只。 灌胃给药， 给药量 20 mL／kg，1次／d，连续7 d，模型组灌胃等体积蒸馏水。末次给药1 h后，于右后足趾部皮下注射1%角叉菜胶溶液0.02 mL致炎，15 min后脱颈椎处死，剪取后双足等同部位，称定质量，以同一小鼠左右后足质量之差为肿胀度，计算肿胀抑制率［18］。

2.2.2 对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响［16，19］小鼠按 “2.2.1” 项下方法分组给药， 末次给药1 h后，小鼠尾静脉注射0.3%伊文思蓝溶液 （10 mL／kg），同时腹腔注射0.6%冰醋酸溶液 （10 mL／kg），15 min后脱颈椎处死，腹腔注射6 mL生理盐水冲洗腹腔，剪开腹腔收集腹腔液，3 000 r／min离心10 min，取上清液，于590 nm波长处测定吸光度。

2.2.3 对小鼠棉球肉芽肿的影响 取小鼠196只，腹腔注射5%水合氯醛 （10 mL／kg）麻醉，无菌条件下在两前肢中间的胸部用弯剪剪毛，75%酒精消毒皮肤，手术剪剪出皮下一小口，用镊子从胸口皮下将棉球 （每粒10 mg，高压灭菌）分别植入小鼠两侧腋下，缝合伤口并用碘伏消毒。术后第2天，小鼠按 “2.2.1”项下方法分组给药，末次给药1 h后脱颈椎处死，剪开皮毛，取出棉球及周围结缔组织，剔去脂肪组织，称定质量，减去原棉球质量后即为肉芽肿湿重，60℃下烘干至恒重，减去原棉球质量后即为肉芽肿干重。

2.3 石油醚部位抗炎作用研究

2.3.1 二甲苯致摘除双侧肾上腺小鼠耳肿胀［20］取小鼠100只，术前1 d以头孢克肟灌胃给药，腹腔注射5%水合氯醛 （10 mL／kg）麻醉，在胸腰椎交界处沿背部正中线、背肋后缘作约0.5 cm长的皮肤、肌肉切口，轻轻摘除腺体和另一侧肾上腺，棉球稍止血后缝合肌肉和皮肤，涂以碘伏，术后第2天以头孢克肟灌胃给药，再连续3 d给予5%葡萄糖生理盐水溶液代替蒸馏水饲养。然后，小鼠随机分为模型组、阳性组及石油醚部位高、中、低剂量组，按“2.2.1”项下方法分组给药，末次给药1 h后，于右耳正反两面各涂二甲苯10 μL致炎，15 min后处死，沿耳根部剪下两耳，6 mm打孔器在两耳相同部位等面积打下圆耳片，称定质量，计算肿胀度和肿胀抑制率，公式分别为肿胀度＝右耳质量－左耳质量、肿胀抑制率＝［（模型组肿胀度－给药组肿胀度）／模型组肿胀度］×100%。

2.3.2 角叉菜胶致摘除双侧肾上腺小鼠足跖肿胀［21-22］取小鼠60只，按 “2.3.1”项下方法摘除双侧肾上腺，按“2.2.1”项下方法分组给药，随后剪碎右足，4 mL生理盐水浸泡［13］， 匀浆后 3 000 r／min离心 10 min， 上清液于－20℃下保存，参照试剂盒操作步骤，采用ELISA法测定SOD活性和MDA、NO水平。

2.3.3 对佐剂性关节炎大鼠的影响［23］大鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松组 （0.00 5 g／kg）及石油醚部位高、中、低剂量组，按 “2.2.1”项下方法给药，每天1次，连续7 d，空白组、模型组给予等体积蒸馏水。末次给药1 h后，于大鼠右足皮下注射0.1 ml弗氏完全佐剂，6 h后麻醉大鼠，腹主动脉取血，37℃下水浴1 h后，4℃、3 000 r／min离心20 min，取血清分装，－20℃下保存，参照试剂盒操作步骤，采用ELISA法测定TNF-α、PGE2、IL-1β、 IL-6、 LTB4水平。

2.4 统计学分析 通过SPSS 19.0软件进行处理，数据均以 （±s）表示，均值比较采用单因素方差分析，假定方差齐性采用LSD法，未假定方差齐性采用Dunnett’s T3法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 赪桐根活性部位筛选及抗炎作用研究

3.1.1 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响 图1显示，与模型组比较，除乙酸乙酯部位低剂量组外，各极性部位组对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀均有显著抑制作用 （P＜0.05，P＜0.01）。

图1 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀的影响（±s， n＝12～14）

3.1.2 对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响图2显示，与模型组比较，除石油醚部位低剂量组外，各极性部位组均能显著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加 （P＜0.01）。

图2 对冰醋酸致小鼠毛细血管通透性增加的影响 （±s，n＝12～14）

3.1.3 对小鼠棉球肉芽肿的影响 图3显示，与模型组比较，各极性部位组对小鼠棉球肉芽肿均有显著抑制作用（P＜0.05， P＜0.01）。

3.2 石油醚部位抗炎作用

3.2.1 对摘除双侧肾上腺小鼠的影响

3.2.1.1 二甲苯致耳肿胀 图4显示，与模型组比较，石油醚部位组显著抑制二甲苯致耳肿胀 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.2.1.2 对角叉菜胶致足跖肿胀的影响 图5显示，与模型组比较，石油醚部位高剂量组显著抑制角叉菜胶致足肿胀 （P＜0.01）。

3.2.2 对MDA、NO水平和SOD活性的影响 图6～8显示，与模型组比较，石油醚部位组显著降低MDA、NO水平 （P＜0.05， P＜0.01）， 升高 SOD 活性 （P＜0.01）。

图3 对小鼠棉球肉芽肿的影响 （±s， n＝12～14）

图4 对二甲苯致耳肿胀小鼠的影响 （±s， n＝10～13）

图5 对角叉菜胶致足跖肿胀小鼠的影响（±s， n＝10～13）

3.2.3 对佐剂性关节炎大鼠的影响 图9～13显示，与模型组比较，石油醚部位组显著降低TNF-α、PGE2、IL-1β、IL-6、 LTB4水平 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 讨论

赪桐根为广西常用壮药，具有清肺热、凉血止血功效，主治肺热咳嗽、咳血、风湿骨痛等［6］，主要含有鞣质、有机酸、皂苷、黄酮类、酚类、植物甾醇、三萜类、挥发油等成分［24］， 其中鞣质［25］、 植物甾醇［26］、 黄酮类［27］、 皂苷［28-29］等具有良好的抗炎作用。临床研究证实，赪银合剂对风热型急性扁桃体炎有较好疗效［15］，赪桐根是其主要君药；陈俊等［16］发现，赪桐根水提物对急、慢性炎症均具有明显作用。

图6 对MDA水平的影响 （±s， n＝8～10）

图7 对SOD活性的影响 （±s， n＝8～10）

图8 对NO水平的影响 （±s， n＝8～10）

图9 对TNF-α水平的影响 （±s， n＝8～10）

图10 对PGE2水平的影响 （±s， n＝8～10）

图11 对IL-1β水平的影响 （±s， n＝8～10）

炎症反应是许多不同类型疾病 （如生物性、化学性及物理性疾病）的共同病理过程，也是机体最基本的抗损伤反应，以红、肿、热、痛为主要临床特征，是致炎因子刺激具有血管系统的活体组织对局部损伤的反应，可分为早、中、晚三期，其中在急性炎症或炎症早期，以血管壁通透性增强、白细胞和蛋白质造成组织肿胀为特征；在慢性炎症或炎症后期，以纤维组织增生、肉芽肿形成为特点［20］。本实验发现，赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位均具有非常明显的抗炎效果，以石油醚部位最强，乙酸乙酯部位次之；通过冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶致小鼠足跖肿胀实验发现，4个部位具有很强的抑制小鼠足肿胀、明显改善炎症早期的通透性增加作用；通过小鼠棉球肉芽肿实验发现，它们对炎症后期也具有显著的抑制作用，可改善肿胀；通过去肾上腺小鼠模型实验发现，石油醚高剂量组有抗炎活性，但有所减弱，推测可能不完全依赖于下丘脑-垂体-肾上腺轴 （HPAA）系统，而是部分依赖机体内源性抗炎系统；通过检测去肾上腺小鼠足肿胀部位炎症因子水平发现，去肾上腺后赪桐根石油醚部位可提高小鼠SOD活性，降低MDA、NO水平，从而发挥抗炎作用。

图12 对IL-6水平的影响 （±s， n＝8～10）

图13 对LTB4水平的影响 （±s， n＝8～10）

超氧化物歧化酶 （SOD）是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊生理活性，也是生物体内清除自由基的首要物质；丙二醛 （MDA）是自由基引发的脂质过氧化反应的一种产物，可激活环氧化酶 （COX），一方面促进花生四烯酸产生前列腺素 （PG），导致细胞代谢紊乱形成炎症，而另一方面可影响白三烯代谢形成炎症［16，24，30-31］； 一氧化氮（NO）是一种重要的炎症介质，能诱导促炎症因子产生，如肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、 白介素-1β （IL-1β） 等。TNF-α、IL-1β、IL-6等均为重要炎症介质，是多种信号通路的关键因素，其中TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞分泌，作为主要的促炎细胞因子，它可与多种类型组织因子和基质蛋白相互作用，使RA关节滑膜细胞增殖，诱导刺激滑膜细胞产生炎症因子、蛋白激酶、前列腺素E（PGE），直接损害组织；IL-1β是对骨吸收和软骨破坏的关键因子；IL-6是由T细胞、单核细胞、巨噬细胞、滑液成纤维细胞产生的多效炎性细胞因子，参与多种生物过程，如T细胞活化、急性期应答诱导、滑液成纤维细胞增殖［32］。另外，前列腺素E2（PGE2）、白三烯B4（LTB4）为花生四烯酸代谢途径产生的2个重要炎症递质，前者可增加血管通透性，而后者可引起白细胞趋化、聚集、脱颗粒，产生超氧阴离子，从而加重炎症反应。

综上所述，赪桐根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇部位具有良好的抗炎作用，以石油醚部位最强，并依赖于HPAA轴内部抗炎系统，其抗炎机制可能与减少MDA、 NO、 TNF-α、 PGE2、 IL-1β、 IL-6、 LTB4 等炎症因子生品、提高SOD活性有关，具体活性成分及其作用机制有待进一步研究。