楮实子对APP／PS1双转基因小鼠海马神经发生的影响

张二飞， 殷 紫， 闫宇辉， 钱 俊， 韩永红

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安223003；2.江苏护理职业学院，江苏淮安223003）

阿尔茨海默病是一种神经退行性病变，为老年痴呆最常见的类型，临床表现为认知功能丧失、记忆功能障碍等［1-3］，主要病理特征为β-淀粉样蛋白过度沉积形成的细胞外老年斑、Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结及神经元丢失［4］，发病机制假说主要包括β淀粉样蛋白假说、Tau蛋白假说、炎症假说、氧化应激假说等［5-7］。

楮实子功效补肾清肝、明目、利尿，用于肝肾不足、腰膝酸软、虚劳骨蒸、头晕目昏、目生翳膜、水肿胀满，具有一定神经保护作用，能提高大鼠慢性脑供血不足后认知功能障碍，其水煎剂能通过调控MAPK通路改善D-半乳糖所致PC12细胞凋亡［8-12］，但尚无对阿尔茨海默病模型的神经保护作用及机制尚未见报道。因此，本实验探讨楮实子对APP／PS1双转基因小鼠海马神经发生的影响。

1 材料

1.1 动物 SPF级8月龄C57BL／6雄性小鼠，购于辽宁长生生物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK （辽） 2013-0001；8月龄 APP／PS1双转基因小鼠，购于北京中科泽晟生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2013-0002，体质量 （30±3）g，分笼饲养，自由摄食饮水，室温20～25℃，相对湿度40%～60%，每天光照12 h，采用PCR法鉴定，选取阳性小鼠用于实验。

1.2 试药 楮实子购自安徽亳州药材市场，经江苏食品药品职业技术学院祝冬青副教授鉴定为正品。多奈哌齐 （批号664081，美国Sigma公司）。TUNEL试剂盒 （南京凯基生物科技发展有限公司）；BrdU （美国 Sigma公司）；小鼠抗 BrdU、GSK-3β， 兔抗 NeuN、 β-catenin、 β-actin抗体 （北京博奥森生物技术有限公司）；羊抗小鼠FITC、驴抗兔Cy3标记二抗 （美国Jackson公司）；辣根过氧化物酶 （HRP）、标记羊抗小鼠IgG、HRP标记驴抗兔IgG（北京鼎国生物技术有限公司）；全蛋白提取、BCA蛋白定量试剂盒 （上海碧云天生物技术有限公司）。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 CM1850冰冻切片机、DMLS2显微镜、DFC500照相系统 （德国徕卡公司）；MS-1水迷宫仪 （成都仪器厂）；水平核酸电泳仪、半干式蛋白转膜仪 （美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 分组 将40只APP／PS1双转基因小鼠随机分为模型组、阳性药组 （10 mg／kg多奈哌齐）及楮实子低、 高剂量组 （1.8、 3.6 g／kg）， C57BL／6小鼠作为对照组，每组10只。

2.2 给药 50 g楮实子用蒸馏水浸泡1 h后煎煮2次，每次2 h，合并药液，浓缩至100 mL，终质量浓度为0.5 g／mL（生药量），小鼠灌胃给药，同时阳性药组小鼠灌胃给予10 mg／kg多奈哌齐，对照组小鼠灌胃给予同体积的蒸馏水，连续6周。

2.3 Morris水迷宫实验 经过6周给药后，采用Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力。检测仪器由1个圆桶 （直径120 cm、高60 cm）、摄像及自动图像采集分析系统组成，桶内分成4个象限，逃生平台 （直径10 cm）置于其中1个象限内，加水 （水温25℃）至水面高于平台2 cm，观察小鼠寻找台面所需时间及穿越平台次数。

2.4 原位末端标记 （TUNEL）法 小鼠给药后处死取脑，制备冰冻切片，根据TUNEL试剂盒说明书操作步骤检测海马区神经细胞凋亡。

2.5 免疫荧光染色 将5 μm脑冰冻冠状切片于室温下晾干，固定、透化、封闭后兔抗NeuN、鼠抗BrdU抗体（1∶150）4℃下孵育过夜，次日滴加羊抗小鼠 Cy3标记、驴抗兔 FITC标记二抗（1∶200）室温孵育1 h，DAPI染核，盖玻片封片，置于荧光显微镜下观察NeuN／BrdU阳性细胞表达。

2.6 Western Blot法 小鼠麻醉后进行心脏灌流，取海马区脑组织，研磨，经蛋白提取、定量、电泳、转膜及显色后凝胶成像分析系统扫描，测定光密度，其中GSK-3β、β-catenin、β-actin抗体稀释浓度分别为1∶800、1∶600、1∶1 000，HRP标记二抗稀释浓度为1∶800。然后，以目的条带、内参蛋白条带光密度比值为指标进行分析。

2.7 统计学分析 SPSS 17.0软件进行处理，数据以 （±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为具有显著性差异。

3 结果

3.1 楮实子对小鼠学习记忆能力的影响 图1A显示，与对照组比较，模型组小鼠潜伏期显著延长（P＜0.01）；与模型组比较，楮实子高剂量组其潜伏期显著缩短 （P＜0.05）。图1B显示，与对照组比较，模型组小鼠穿越平台次数显著降低 （P＜0.01）；与模型组比较，楮实子高剂量组其次数显著增加 （P＜0.05）。

3.2 楮实子对小鼠海马区神经细胞凋亡的影响 图2显示，与对照组比较，模型组小鼠海马区凋亡细胞数显著增加 （P＜0.01）；与模型组比较，楮实子高剂量组其数量显著降低 （P＜0.01）。

图1 楮实子对小鼠学习与记忆能力的影响Fig.1 Effects of Broussonetiae Fructus on mouse learning and memory activities

图2 楮实子对小鼠海马区神经细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of Broussonetiae Fructus on nerve cell apoptosis in mouse hippocampal area

3.3 楮实子对小鼠海马区神经发生的影响 图3显示，与对照组比较，模型组小鼠海马新生神经元数显著降低 （P＜0.01）；与模型组比较，楮实子高剂量组其数量显著增加 （P＜0.01）。

图3 楮实子对小鼠海马区神经发生的影响Fig.3 Effect of Broussonetiae Fructus on neurogenesis in mouse hippocampal area

3.4 楮实子对GSK-3β、β-catenin蛋白表达的影响

图4显示，与对照组比较，模型组GSK-3β蛋白表达显著升高，β-catenin蛋白表达显著降低 （P＜0.01）；与模型组比较，楮实子高剂量组GSK-3β蛋白表达显著降低，β-catenin蛋白表达显著升高（P＜0.05）。

4 讨论

阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病，临床表现为患者生活能力下降、记忆力减退，并出现神经行为异常、认知功能障碍，甚至生活不能自理，随着老龄化加剧，患病人数将保持快速增长，预计到2030年全世界患者将达到6 500万左右，将会对全社会造成严重负担［13］。

神经干细胞在一定条件下可分化为神经元及胶质细胞，参与神经功能维持、修复等过程，称为神经发生［14-15］。成年哺乳动物海马区仍然具有神经发生的能力，打破了中枢神经系统神经元不能再生的观点，也是阿尔茨海默病患者最易受损的区域之一，它主要负责学习记忆功能，故患者在早期均会出现学习记忆障碍［16-17］。

图4 楮实子对GSK-3β、β-catenin蛋白表达的影响Fig.4 Effects of Broussonetiae Fructus on GSK-3β，β-catenin protein expressions

APP／PS1双转基因小鼠是公认的阿尔茨海默病动物模型之一［18］，可表达突变的人类早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉样前体蛋白 （APPswe）融合体，人类早老素基因的第9个外显子突变缺失会导致早发性老年痴呆症［19］。本实验发现，高剂量（3.6 g／kg） 楮实子能显著改善APP／PS1小鼠学习记忆能力。研究表明，在阿尔茨海默病发生时，Aβ大量沉积，导致海马神经元大量凋亡和丢失，从而引起海马神经发生障碍。利用TUNEL法和NeuN／BrdU免疫荧光染色检测小鼠海马CA3区神经细胞凋亡及神经元新生情况，发现模型组神经细胞凋亡数显著增多，新生神经元数显著降低 （P＜0.01），而给予高剂量 （3.6 g／kg） 楮实子后海马区神经细胞凋亡显著减少 （P＜0.01），新生神经元数也显著增加 （P＜0.01），表明它能促进 APP／PS1小鼠海马神经发生。

Wnt／β-catenin信号通路是影响神经干细胞增殖、分化和神经元凋亡最重要的通路之一，当通路激活时可引起GSK-3β表达下降，β-catenin水平升高［20］。 研究表明， 激活 Wnt／β-catenin 信号通路能促进神经干细胞增殖，刺激其分化为神经元，并能减少神经元的凋亡，在哺乳动物中枢神经系统神经元再生中起重要作用［21-23］。本实验发现，模型组小鼠海马区GSK-3β蛋白表达显著升高，β-catenin蛋白表达显著降低 （P＜0.01），而给予高剂量（3.6 g／kg）楮实子后 β-catenin蛋白表达显著升高，GSK-3β蛋白表达显著降低 （P＜0.05），表明它能减少神经元凋亡、促进神经发生，在一定程度上与激活可Wnt／β-catenin信号通路。

综上所述，楮实子可减少阿尔茨海默病小鼠海马神经细胞凋亡，促进神经发生，改善学习记忆能力，其机制可能与激活 Wnt／β-catenin信号通路有关。