苏合香对大鼠心肌缺血的影响

陈 念， 王 建， 樊亚梅， 马 骁， 郭晓庆， 董泰玮， 马 荣， 谢 倩

（成都中医药大学药学院，四川成都611137）

苏合香为金缕梅科植物苏合香树Liquidambar orientalis Mill．树干渗出的香树脂，经加工精制而成，其味辛、性温，归心、脾经，具有开窍、辟秽、温散止痛功效［1］，临床上常与芳香温通药配伍以治疗胸痹心痛，如苏合香丸。本实验探讨苏合香对心肌缺血大鼠的影响，为阐释该药材抗急性心肌缺血研究提供实验基础，进而为临床应用提供依据。

1 材料

1.1 动物 健康成年SD大鼠，SPF级，体质量230～270 g，雌雄各半，购于成都达硕实验动物研究所，合格证号SCXK（川）2013-15，于成都中医药大学实验动物中心饲养。然后，在成都中医药大学国家中医药管理局中药药理三级科研实验室进行实验 （编号TCM-09-315）。

1.2 试药 苏合香购于西南药都中药材市场。生理盐水 （四川科伦药业股份有限公司，M14110208）；硝酸甘油 （上海信谊药厂有限公司，批号F31021149）；吐温 （天津市瑞金特化学品有限公司，批号20150104）；水合氯醛 （成都市科龙化工试剂厂，批号2013101801）。

参考课题组前期报道［2］，用5%吐温配制药液，给药剂量参照2015版 《中国药典》，分别以成人 （60 kg） 日用量 （苏合香 1 g） 的 40、20、10倍作为高、中、低剂量，即 0.667、0.333、0.167 g／kg。阳性药硝酸甘油用5%吐温配制药液，按照成人 （60 kg）日用剂量 （每次0.5 mg，每天不超过3次）及前期预实验所选有效剂量（1 mg）， 配制为人体等效剂量0.01 mg／kg。

1.3 仪器 UPH-1-10T优普超纯水制造系统 （成都超纯科技有限公司）；BP11D电子天平 ［赛多利斯科学仪器 （北京）有限公司］；KQ5200E型超声仪 （昆山市超声仪器有限公司）；手术器械（苏州六六视觉科技股份有限公司）；BL-420S生物系统分析仪 （成都泰盟科技有限公司）；肌酸激酸同工酶检测试剂盒 （批号20180317）、GOT试剂盒 （批号20180315）、LDH微板检测盒 （批号20180515） （南京建成生物工程研究所）；酶标仪 （南京华东电子集团有限公司，批号DG5032）。

2 方法

2.1 分组及给药 将84只大鼠按体质量、性别随机分为假手术组、模型组、溶剂组、阳性药组及苏合香高、 中、 低剂量组 （0.167、 0.333、 0.667 g／kg）， 每组12只。大鼠适应性喂养3 d后给药，苏合香组均按20 mL／kg剂量灌胃给予相应药液，阳性药组灌胃给予硝酸甘油溶液，模型组与假手术组灌胃给予生理盐水，溶剂组灌胃给予5%吐温，1次／d，连续3 d。给药前，大鼠禁食不禁水12 h，末次灌胃30 min后造模，造模后第2天继续灌胃给药，1 次／d， 连续 3 d。

2.2 造模 第3天预给药30 min后，腹腔注射100 g／L水合氯醛 （300 mg／kg） 麻醉， 背位固定，行气管插管，连接呼吸机辅助呼吸。将Ⅱ导联针状电极连于BL-420四通道生物信号分析系统。大鼠胸部去毛消毒后，沿左胸骨旁线剪开皮肤，分离肌肉，暴露肋骨，剪开第3、4根肋软骨之间的间隙，扩胸器扩宽，暴露心脏，小弯针4／0号丝线从肺动脉圆锥左缘进入，在左心耳下缘2 mm进针，深度约0.5 mm，连同穿过的心肌水平结扎冠状动脉LAD［3-5］（假手术组只穿线不结扎），监测心电图，当ST段下移大于0.1 mV即为造模成功，排除淤血和空气，缝合线依秩缝合胸腔、皮肤，大鼠恢复自主呼吸后停止人工呼吸，放于笼内饲养。

2.3 心电图、血流动力学指标测定 第6天给药30 min后， 腹腔注射100 g／L 水合氯醛（300 mg／kg）麻醉，背位固定，将针状电极、心导管连接于BL-420四通道生物信号分析系统。大鼠颈部剪毛，仔细分离右颈总动脉，插入充有肝素生理盐水的心导管至左心室，连接压力传感器监视心室内压，记录5、10、15、20 minⅡ导联心电图指标。 以及 5、10、 15、 20、 25、 30、 35、 40 min 左 室 平 均 压（LVAP）、 左室舒张期末压 （LVEDP）。

2.4 心梗死率测定 实验结束后，大鼠心脏剪去心耳，切成5片，37℃下于1%TTC溶液中温孵15 min，4%多聚甲醛固定24 h，正常心肌染为红色，梗死心肌不着色或浅着色，称取左心室质量，再剪取梗死心肌称定质量，计算心肌梗死面积百分比 （梗死心肌质量／左心室质量×100%）。

2.5 心肌组织HE染色 取出大鼠心脏，于冰生理盐水中洗去余血，滤纸吸去多余生理盐水，10%福尔马林固定，沿左右心室纵面靠近结扎处取材，脱水，石蜡包埋，制片 （厚度4 μm），HE染色，进行病理切片，光镜下分别观察各组心肌中性粒细胞浸润、水肿、充血、出血、细胞变性、坏死情况。无病变计0分，病变面积小于10%计1分，10%～20%计2分，30%～50%计3分，大于50%计4分。

2.6 血清生化指标测定 心电采集完毕之后，大鼠腹主动脉取血，静置15～30 min，3 500 r／min离心10 min，取血清上清液，按试剂盒操作步骤检测大鼠血清AST、LDH、CK-MB活性。

2.7 统计学分析 通过SPSS21.0进行处理，数据以 （±s）表示，组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析。P＜0.05表示有显著性差异。

3 结果

3.1 苏合香对ST段的影响 表1显示，与假手术组比较，模型组于5、10、15、20 minST段均显著下移 （P＜0.01）；与溶剂组比较，苏合香中剂量组各时间点ST段均显著回移 （P＜0.05，P＜0.01），而高剂量组于5、10 min显著回升 （P＜0.01）。

表1 苏合香对ST段的影响 （±s， n＝12）Tab.1 Effect of Styrax on ST segment（±s， n＝12）

表1 苏合香对ST段的影响 （±s， n＝12）Tab.1 Effect of Styrax on ST segment（±s， n＝12）

注：与假手术组比较，∗∗P＜0.01；与溶剂组比较，▲P＜0.05，▲P＜0.01

组别 5 min 10 min 15 min 20 min假手术组 0.20±0.08 0.19±0.06 0.17±0.05 0.18±0.05模型组 0.01±0.01∗∗ 0.02±0.03∗∗ 0.02±0.02∗∗ 0.03±0.04∗∗溶剂组 0.01±0.01∗∗ 0.01±0.01∗∗ 0.01±0.01∗∗ 0.02±0.01∗∗阳性药组 0.08±0.06∗∗▲ 0.11±0.11∗∗▲▲ 0.09±0.13∗∗▲ 0.07±0.10∗∗▲苏合香低剂量组 0.03±0.03∗∗ 0.03±0.03∗∗ 0.03±0.02∗∗ 0.05±0.04∗∗苏合香中剂量组 0.08±0.08∗∗▲ 0.07±0.06∗∗▲ 0.07±0.06∗∗▲ 0.08±0.07∗∗▲▲苏合香高剂量组 0.11±0.13∗∗▲▲ 0.10±0.09∗∗▲▲ 0.06±0.07∗∗ 0.04±0.03∗∗

3.2 苏合香对LVEDP、LVAP的影响 表2～3显示，与假手术组比较，模型组LVEDP、LVAP于10、15、20、 25 min显著升高 （P＜0.05， P＜0.01）；与溶剂组比较，苏合香低剂量组两者于5、10、 15、 20、 25、 30 min显著降低 （P＜0.01）， 中剂量组于5、10、15、20 min显著降低 （P＜0.05，P＜0.01）。

表2 苏合香对LVEDP的影响 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.2 Effect of Styrax on LVEDP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 苏合香对LVEDP的影响 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.2 Effect of Styrax on LVEDP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与溶剂组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别LVEDP／mmHg 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min假手术组 74.45±8.59 78.47±6.49 66.69±18.14 58.01±15.54 60.71±10.73 68.42±19.78 62.26±14.95 81.67±20.12模型组 93.54±15.68 99.90±12.36∗ 94.95±10.83∗ 100.88±19.30 95.04±6.51∗∗ 70.65±49.48 76.50±54.7 74.37±53.12溶剂组 95.61±0.53∗∗ 97.96±3.41∗∗ 102.78±4.48∗ 100.38±8.97∗∗ 101.75±3.53∗∗ 100.02±3.07 87.67±14.16 94.49±13.12阳性药组 66.17±7.91▲▲ 76.62±12.10▲ 80.21±14.09▲ 65.01±17.64▲ 68.31±16.56▲ 64.57±18.65 60.61±16.24 63.58±19.35苏合香低剂量组 63.60±5.11▲▲ 73.03±7.55▲▲ 68.22±11.69▲▲ 71.23±5.42▲▲ 73.48±7.69▲▲ 75.92±7.88▲▲ 73.37±9.48 82.08±15.97苏合香中剂量组 80.04±7.94▲ 81.57±9.52▲ 84.52±2.99▲▲ 85.25±6.11∗▲ 90.28±7.62∗∗ 87.28±11.84 102.41±15.22∗∗ 98.07±16.59苏合香高剂量组 85.96±7.59 81.56±13.25 78.28±15.77 80.25±18.01 79.48±18.71 72.42±30.01 74.55±18.82 74.73±28.65

表3 苏合香对LVAP的影响 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.3 Effect of Styrax on LVAP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

表3 苏合香对LVAP的影响 （±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）Tab.3 Effect of Styrax on LVAP（±s， n＝4， 1 mmHg＝0.133 kPa）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与溶剂组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别LVAP／mmHg 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min假手术组 79.74±6.74 81.08±6.75 69.99±16.6 63.11±15.73 66.56±13.87 74.35±26.98 66.70±14.97 84.18±16.45模型组 95.26±11.7 100.76±10.67∗ 96.09±8.25∗ 100.36±17.30∗ 93.14±3.92∗∗ 73.12±51.26 76.16±54.53 73.43±52.79溶剂组 89.14±12.3 96.81±4.29∗∗ 98.15±8.21∗ 94.88±12.15∗ 97.09±9.30∗ 97.76±7.67 90.15±13.21 94.83±10.76阳性药组 70.86±8.70▲ 76.48±10.58▲▲ 81.41±12.71 69.68±18.80 73.29±18.58▲ 69.99±20.64▲ 66.02±19.28 73.48±25.62苏合香低剂量组 64.86±5.50∗∗▲▲ 72.92±6.84▲▲ 69.81±10.92▲▲ 72.93±3.81▲▲ 74.44±6.20▲▲ 77.02±6.83▲▲ 74.55±8.77 81.38±13.58苏合香中剂量组 80.56±7.13 86.42±9.07 82.22±4.45▲ 87.89±7.33 94.38±9.17∗ 92.87±8.40 106.08±18.63∗100.87±12.65苏合香高剂量组 69.11±46.65 90.68±21.36 84.89±18.83 85.17±17.60 83.87±17.90 78.36±27.38 56.88±41.80 67.66±27.39

3.3 苏合香对心肌梗死面积百分比的影响 图1显示，与假手术组比较，模型组心肌梗死率显著增加 （P＜0.01）；与溶剂组比较，苏合香低剂量组其梗死率显著降低 （P＜0.01）。

3.4 心肌组织染色 表4、图2显示，与模型组、溶剂组比较，苏合香组损伤面积 （红色曲线范围）和炎性细胞浸润、变性坏死、出血程度均显著改善（P＜0.05，P＜0.01），而且中剂量组还可显著改善炎细胞浸润 （P＜0.05）。

图1 苏合香对心肌梗死率的影响Fig.1 Effect of Styrax on myocardial infarction rate

3.5 苏合香对CK-MB、AST、LDH活性的影响表5显示，与假手术组比较，模型组 CK-MB、AST、LDH 活性显著升高 （P＜0.05， P＜0.01）；与溶剂组比较，苏合香低、高剂量组CK-MB活性显著降低 （P＜0.05），低、中剂量组LDH活性显著下降 （P＜0.05，P＜0.01），各剂量组AST活性显著下降 （P＜0.05， P＜0.01）。

4 讨论

心肌缺血是指心脏血液灌注及供氧减少，导致心肌代谢失常、心脏无法正常工作的一种病理状态［6］，长期心肌缺血可发展为心肌梗死或猝死。现代药理研究表明，苏冰滴丸、冠心苏合丸具有显著抗心肌缺血作用［7-10］； 许福会［10］报道， 苏合香可预防性改善24 h心梗大鼠心电ST段的抬高，减少大鼠心肌梗死率；但目前鲜有单味苏合香改善心肌缺血的研究，故本实验开展了初步探讨。

表4 苏合香对心肌组织的影响 （±s， n＝6）Tab.4 Effect of Styrax on myocardial tissues（±s， n＝6）

表4 苏合香对心肌组织的影响 （±s， n＝6）Tab.4 Effect of Styrax on myocardial tissues（±s， n＝6）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与溶剂组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 炎症细胞 水肿 出血 变性 坏死 总评分假手术组 0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.41 0.17±0.41 0.17±0.41 0.50±0.55模型组 1.50±0.55∗∗ 1.50±0.55∗∗ 2.33±0.52∗∗ 0.50±0.55▲ 3.50±0.55∗∗ 9.33±1.37∗∗溶剂组 1.50±0.84∗∗ 2.17±0.98∗∗ 2.00±0.89∗∗ 1.83±1.33∗ 3.50±0.84∗∗ 10.83±2.71∗∗苏合香低剂量组 1.00±0.00∗∗ 0.00±0.00▲▲ 1.33±0.52∗∗ 0.17±0.41▲▲ 2.67±0.82∗∗▲ 5.17±0.75∗∗▲▲苏合香中剂量组 0.83±0.41∗∗▲ 0.67±0.52▲▲ 1.33±0.82∗∗ 0.50±0.55▲ 2.67±0.52∗∗▲ 6.00±1.90∗∗▲▲苏合香高剂量组 1.50±0.55∗∗ 1.00±0.89∗∗▲▲ 1.33±0.52∗∗ 1.00±1.55 2.33±0.82∗∗▲▲ 7.17±3.06∗∗▲▲

图2 各组心肌组织HE染色Fig.2 HE staining of myocardial tissues in various groups

表5 苏合香对CK-MB、LDH、AST活性的影响 （±s， n＝6）Tab.5 Effects of Styrax on CK-MB，LDH and AST activities（±s， n＝6）

表5 苏合香对CK-MB、LDH、AST活性的影响 （±s， n＝6）Tab.5 Effects of Styrax on CK-MB，LDH and AST activities（±s， n＝6）

注：与假手术组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与溶剂组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 CK-MB／（U·L－1） LDH／（U·L－1. ） AST／（U·L－1）假手术组 399.36±57 125.47±40.49 23.35±5.62模型组 667.75±100.07∗ 787.82±145.58∗∗ 44.47±0.92∗溶剂组 661.99±41.82∗ 900.63±276.43∗∗ 49.60±7.78∗∗阳性药组 331.56±52.19▲▲ 521.61±245.53∗∗ 23.57±4.90▲▲苏合香低剂量组 435.08±83.62▲ 279.27±286.02▲▲ 26.75±8.60▲▲苏合香中剂量组 678.55±98.99∗ 553.50±140.12∗∗▲ 32.22±4.81▲苏合香高剂量组 510.89±54.74▲ 810.82±347.37∗∗ 11.79±2.85▲▲

大鼠结扎心脏冠状动脉左前降支是造成心肌缺血损伤模型的常用方法之一［11］，它可致心脏供血不足，所引起的心肌缺血、梗死模型与人类心肌缺血梗死有相似病理生化和形态学改变，故本实验采用该方法模拟大鼠心肌缺血，并以ST段为判定心肌缺血的重要指标，当其呈水平型、下斜型或上斜型下移，幅度大于0.05 mV时，可认为心肌缺血［12-14］。结果显示，模型组大鼠 ST段显著下移（大于0.1 mV），提示造模成功，给予以5%吐温时也无改善，而0.333、0.667 g／kg苏合香可有效抑制其下移，提示它有改善心肌缺血作用。

左心室舒张末压 （LVEDP）是评价左心功能的重要方法，心室收缩能力降低时，心室内血液排出量减少，剩余血液增多，从而使其增加［15-18］。本实验发现，模型大鼠LVEDP显著增高，提示左心室收缩，舒张功能障碍，而苏合香则有效降低LVEDP，可能是它通过改善心脏收缩功能来改善心肌缺血。

当心肌细胞缺氧时，细胞发生肿胀、胞质透明、淡染，重者发生气球样变性，可使心肌收缩力量减弱，进一步发展可导致细胞坏死；当炎症发生时，坏死细胞及周围可渗出中性粒细胞，加重坏死及局部实质细胞溶解。本实验发现，模型大鼠心肌细胞呈水肿、坏死，并伴有出血及中性粒细胞浸润，5%吐温有加重心肌细胞变性趋势，而苏合香可有效抑制心肌细胞变性、坏死，改善损伤程度，从而保护心肌。

心肌梗死时，血清中肌酸激酶水平迅速提高，尤其是肌酸激酶同工酶 （CK-MB）诊断的特异性最高［19］。本实验发现，术后第3天模型组、溶剂组大鼠血清CK-MB水平显著增高，而苏合香能有效抑制，质量浓度0.167 g／kg时改善最明显，提示它可减缓心肌损伤程度；乳酸脱氢酶（LDH）、AST主要分布于心肌，心肌梗死时两者活性升高，故也用于心肌疾病的诊断［20-21］，本实验发现模型大鼠血清中两者活性显著增高，而苏合香则能显著抑制，也以质量浓度0.167 g／kg时效果最佳。聚类分析见图3，可知苏合香低剂量组 （0.167 g／kg）抗心肌缺血作用最佳，其次是中剂量组 （0.333 g／kg）， 而高剂量组 （0.667 g／kg）较差，即疗效与剂量呈负相关。

图3 抗心肌缺血作用聚类分析图Fig.3 Cluster analysis diagram for anti-myocardial ischemia effect

综上所述，苏合香可通过改善心功能、减少心肌梗死面积、减缓心肌细胞坏死、降低心肌酶活性，从而有效防治大鼠心肌缺血损伤，并以低剂量组作用最佳。但本实验仅对苏合香抗心肌缺血的剂量及药效进行探讨，今后将从PI3K／Akt通路方面开展研究，因其能参与调控心肌缺血相关凋亡因子（Caspase-3、 Caspase-9、 Bcl2、 Bax）、 相关扩血管因子表达 （eNOS、VEGF等）、M1／M2型巨噬细胞分泌的多种细胞因子和酶类，进而修复损伤，改善心肌缺血和心肌梗死［22-25］，相关作用是否与调控该通路有关是有待解决的问题。