接种比例和接种物驯化对榨汁橙渣厌氧发酵的影响

席 江 艾 平 袁 萧 龙 燕 张衍林

(1.华中农业大学工学院， 武汉 430070； 2.农业农村部沼气科学研究所， 成都 610041)

0 引言

2016年全球橙种植面积超过3.96×106hm2，总产量超过7×107t，而中国橙产量位于全球第二，产量超过8×106t，占全球橙产量的11.5%[1]。全球30%～50%的柑橘被用于鲜食，剩余部分被用于加工，主要生产果汁、果酱、果胶和其他食品[2]，柑橘加工后残渣的质量达到了鲜果的50%～60%，主要包含皮、种子和果肉残渣[3]。我国每年会产生超过5×106t柑橘废渣，除去一小部分被用于果胶的提取和动物饲养，绝大多数废渣被直接丢弃或填埋[4]。榨汁橙渣富含果胶等有机质，适宜采用厌氧生物降解手段进行处理，既环保，又能回收能源，发酵之后的沼渣还可以作为一种土壤改良剂，替代部分化肥的使用，促进作物生长，缓解土壤板结[5]。

榨汁橙渣易酸化的特性和橙皮中含有对微生物有抑制作用的精油常会导致厌氧发酵不正常或产气率较低。FAGBOHUNGBE等[6]采用3～3.26的接种比例(接种物与原料的挥发性固体质量比，Inoculum and substrate ratio， ISR)开展橙皮的厌氧发酵，尽管加入了生物炭，但得到最高甲烷累积产率仅154 mL/g，发酵过程中均出现了不同程度的停滞。SANJAYA等[7]研究了中温条件下，橙的种子、果皮和果肉的甲烷累积产率，选择的ISR为4，橙皮的甲烷累积产率只有48.23 mL/g，研究认为是因精油中柠檬烯等一些有芳香味的化合物对厌氧发酵产生了抑制，可能使用的接种物对橙皮适应性较差而同时添加量又不足，才造成厌氧发酵异常和产气率较低。WIKANDARI等[8]在30 mL厌氧发酵体系中添加20 mL接种物，仍只得到131 mL/g的甲烷累积产率，说明以这类废弃物为发酵原料可能需要更高的ISR。还有一些研究通过水蒸气蒸馏[3]、溶剂萃取[8]、汽爆[9]和生物降解[4]等预处理手段以促进橙皮的厌氧发酵。FORGCS等[9]通过汽爆预处理柑橘榨汁渣，使甲烷累积产率提高了426%, 但预处理前的甲烷累积产率仅102 mL/g，可能是因原料添加量较高(接种物添加较少)而导致预处理前甲烷累积产率较低。一些其他的预处理如生物预处理之后甲烷累积产率也只有176.05 mL/g[4]，且没有通过优化厌氧发酵体系来充分挖掘产甲烷潜力。对于榨汁橙渣厌氧发酵的研究，多集中于不同预处理的优化，这些预处理均需要额外的能耗或化学试剂添加，而不同接种比例和接种物驯化对榨汁橙渣厌氧发酵影响的研究相对较少。

因此，本文以榨汁橙渣为厌氧发酵原料，通过监测不同ISR条件下榨汁橙渣厌氧发酵产甲烷量、pH值和挥发酸含量，比较接种物和发酵结束后厌氧发酵体系中细菌和古菌群落组成的变化，系统分析榨汁橙渣厌氧发酵的规律，同时，通过监测驯化后接种物的厌氧发酵甲烷产气量，分析通过驯化接种物促进榨汁橙渣厌氧发酵的有效性和可行性，为榨汁橙渣厌氧发酵及其预处理优化研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与接种物

实验用榨汁橙渣(Orange pressing waste, OPR)取自“天使之橙”鲜榨橙汁自助贩卖机，手动分选出橙皮渣(Orange peel waste, OPW)和橙肉渣(Orange pulp waste, OPU)，OPW与OPU鲜质量比为2.39∶1，经粉碎和过10目筛后，抽真空-20℃分别保存备用。接种物取自四川省德阳市正常运行的集中供气工程，该工程以猪粪为发酵原料。接种物取回后装入5 L厌氧发酵瓶中，35℃水浴放置一段时间直到不再产气为止。OPW、OPU和接种物的总固体(Total solid, TS)、挥发性固体(Volatile solid, VS)和柠檬烯含量见表1。

表1 榨汁橙皮渣、橙肉渣和接种物理化特性Tab.1 Characteristics of OPW, OPU and inoculum

验证实验的发酵原料为夏橙榨汁渣，该夏橙产自湖北省宜昌市秭归县，手动剥下橙皮，橙肉渣为橙肉经飞利浦HR871/00型榨汁机榨汁后的残渣，夏橙橙皮渣和橙肉渣VS质量分数分别为19.85%和13.94%，OPW与OPU鲜质量比为1.97∶1，经粉碎和10目筛过筛后，抽真空-20℃分别保存备用。

1.2 厌氧发酵实验

厌氧发酵装置采用全自动甲烷潜力测试系统(Bioprocess AMPTSII)，发酵瓶容积为400 mL，沼气通过3 mol/L NaOH溶液吸收后进入流量自动记录装置，装置将甲烷产气量自动换算成标准状态并记录，厌氧发酵装置示意图见图1。每隔1 d取4 mL发酵液用于pH值和挥发酸(Volatile fatty acids, VFAs)测量。厌氧发酵温度为35℃，ISR设置见表2，每个处理设置2个重复。采用修正的Gompertz 模型描述厌氧发酵过程[10]，模型公式为

式中p——t时刻的单位挥发性固体累积甲烷产量，mL/g

p0——单位挥发性固体最大产甲烷潜力，mL/g

Rmax——单位挥发性固体最大产甲烷速率，mL/(g·d)

λ——停滞期，d

t——实验持续时间，d

图1 厌氧发酵装置示意图Fig.1 Experimental sketch of anerobic digestion device1.液样取样口 2.厌氧发酵瓶 3.水浴锅 4.导气管 5.CO2吸收瓶 6.流量自动记录装置

验证实验采用相同厌氧发酵装置，ISR分别为8、6、4和2，每个处理设置2个重复，固定发酵原料总VS质量为2 g。

1.3 参数测量方法

TS和VS含量采用差重法测量，取10 g样品，TS测量在(105±5)℃干燥24 h，VS含量测量在550～600℃马弗炉中灼烧4 h； pH值采用梅特勒 FE28 pH计进行测量; VFAs含量的测量使用岛津GC-2030型气相色谱仪(日本)，检测器为火焰离子化检测器，色谱柱为IntertCap WAX型毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，进样口温度200℃，柱箱温度95℃保持2 min，以10℃/min升温至160℃，继续以400℃/min升温至240℃，保持5 min。柠檬烯含量测量使用岛津GCMS-TQ8050型三重四极杆气相色谱质谱联用仪，模式选择Q3Scan，色谱柱使用Rtx-5MS型毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250℃，柱温箱温度50℃保持1 min，以10℃/min的速率上升到280℃，保持5 min，离子源温度200℃。

1.4 细菌和古菌多样性分析

取样品10 mL，于-80℃下保存。使用E.Z.N.A.soil试剂盒(美国Omega Bio-tek公司)进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000型紫外可见光分光光度计进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质，检测合格后用引物Arch344F(5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′)和Arch915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′)，338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分别进行PCR扩增，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序，数据进行OUT抽平后进行多样性分析。

2 结果与讨论

2.1 不同ISR对厌氧发酵产甲烷规律的影响

2.1.1甲烷日产气率

ISR为8、6、4的处理表现出相似的产甲烷规律，见图2。第1天达到第1个产气高峰之后产气量下降，随后上升达到第2个产气高峰，且第2个产气高峰的日产气率高于第1个产气高峰。但在第1个产气高峰之后的产气下降幅度和时长有所区别，ISR为8、6、4分别在第3、3、4天达到甲烷日产气率相对低点，分别为28.15、21.05、4.58 mL/g，接种比例高的先达到相对低点，同时甲烷日产气率也较高，随后分别在第5、6、9天分别达到第2个产甲烷高峰，分别为52.9、49.8、41.9 mL/g，接种比例高的先达到第2个产气高峰，且甲烷日产气率也较高。ISR为2的处理发生了可逆的酸化，在第1天达到第1个产气高峰之后，产气迅速停滞，直到第8天才恢复产气，并在第10天达到第2个产气高峰，甲烷日产气率达到23.48 mL/g。这种现象反映了产酸和产甲烷速率的失衡，产酸产生的VFAs积累又导致pH值的下降，进一步抑制产甲烷过程[11]，在这个ISR下厌氧发酵不能正常进行。

2.1.2甲烷累积产率

从图2可以看出，ISR为8和6的甲烷累积产率相近，分别为320.0 mL/g和304.9 mL/g，说明不能通过进一步增加接种物量的方式来提高原料产气率。这个数据与CALABRO等[12]、RUIZ等[5]和NEGRO等[13]分别报道的361、357.3、285 mL/g相近，结果略低于KAPRAJU等[14]报道的490 mL/g，这种差异可能是原料理化特性差异造成的。但实验结果高于FORGCS等[9]报道的102 mL/g和FAGBOHUNGBE等[6]报道的165.9 mL/g，这可能是由于他们添加的接种物量不足而导致原料没有被充分利用。

图2 ISR为2～8的甲烷日产气率和累积产率Fig.2 Daily and cumulative methane production of ISR 2～8

ISR为4和ISR为2的甲烷累积产率低于ISR为8和ISR为6时的数值。ISR为4的甲烷累积产率为242.6 mL/g，是ISR为8和6的甲烷累积产率的75.8%和79.6%。而ISR为2的甲烷累积产率仅为111.4 mL/g，是ISR为8和6的甲烷累积产率的34.8%和36.5%。从累积产甲烷的曲线可以看出，第1天之后厌氧发酵进入停滞阶段，尤其是ISR为2时的停滞期长达7 d。

根据表1和表2可以计算出添加到厌氧发酵体系中柠檬烯的质量浓度为490 mg/L，这个浓度在中温条件下并不会对厌氧发酵体系产生显著抑制[12]， ISR为4和2的处理的累积产甲烷量低，主要是因为接种物量较少，不能充分利用底物。

2.1.3pH值和VFAs含量

厌氧发酵系统pH值的变化与VFAs(乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸含量之和)积累呈负相关(图3)。ISR为8、6、4的处理在第2天挥发酸质量浓度达到峰值，分别为1 445.89、1 806.05、2 067.37 mg/L，随接种比例增加，挥发酸质量浓度峰值降低，在第10天已经检测不出挥发酸。ISR为2的处理是在第4天挥发酸质量浓度才达到峰值2 201.92 mg/L，呈先上升再下降的规律，在第10天挥发酸质量浓度仍达到279.24 mg/L，直到第12天才检测不出挥发酸。同时，随着VFAs含量的减少，pH值在逐渐上升。产甲烷的最适宜pH值是6.8～8.5[15]， ISR为8和6的处理pH值一直高于7。ISR为4的处理在第2天pH值低于6.8，此后逐步恢复到7以上。而ISR为2 的处理在第6天之前pH值也一直维持在6.8以下，直到第8天 pH值才恢复到6.8以上，同时产甲烷也恢复。由于榨汁橙渣pH值在3～4[3]，其低pH值和易酸化特性是影响厌氧发酵效果的一个重要因素，通过增加接种量可以有效提高发酵系统的缓冲能力，防止发酵过程中pH值大幅下降。

图3 ISR为2～8 时pH值和挥发酸含量变化图Fig.3 Changes of pH and VFAs of ISR 2～8

2.2 不同ISR对微生物多样性的影响

2.2.1细菌群落组成

由图4可知，接种物中主要是硬壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)，相对丰度分别达到86.96%、4.39%和4.48%，放线菌门(Actinobacteria)、Atribacteria和绿弯菌门(Chloroflexi)相对丰度较低，分别为2.26%、0.52%和0.32%。其他的一些研究也发现厌氧发酵系统中硬壁菌门和拟杆菌门细菌为优势菌群[16]，放线菌门和绿弯菌门也常见于产甲烷的厌氧发酵装置和废水处理工程，但它们在产甲烷过程中的作用并不清楚[15]。

图4 不同ISR发酵前后细菌群落组成Fig.4 Composition of bacterial community before and after anaerobic digestion

在门水平，ISR 为4、6和8的沼渣中硬壁菌门和拟杆菌门相对丰度最高，分别为79.90%～82.86%和3.33%～11.66%，LI等[17]发现这两个门的细菌在纤维素的降解中发挥重要作用；Atribacteria和绿弯菌门相对丰度均高于接种物，但相对丰度随ISR 下降而降低；变形菌门和放线菌门相对丰度低于接种物；Cloacimonetes门则只存在于榨汁橙渣发酵后的沼渣中，这类细菌被认为与氨基酸、丙酸、丁酸以及纤维素的降解有关[18]，且相对丰度随接种比例降低而下降。ISR为2沼渣的细菌群落组成与其他处理相比，则表现较大差异，硬壁菌门相对丰度下降到65.10%，变形菌门相对丰度上升到19.09%，绿弯菌门和Cloacimonetes门未检测到。

在纲水平，ISR为4、6、8的沼渣中细菌群落组成相较接种物存在明显差异，表现为梭菌纲(Clostridia)相对丰度下降到57.74%～61.7%，而同属于硬壁菌门的芽孢杆菌纲(Bacilli)相对丰度增加到6.06%～8.20%，拟杆菌纲(Bacteroidia)相对丰度则增加到9.65%～13.00%。梭菌纲和拟杆菌纲的细菌被认为主要参与水解和产酸过程[19]。同样地，ISR 为2沼渣中芽孢杆菌纲相对丰度低于其他处理，仅1.88%，这可能导致底物水解产酸过程受影响，但β-变形菌纲(Betaproteobacteria)丰度高于其他处理，达到15.91%。

在门水平和纲水平，ISR为4、6和8与接种物的细菌群落均有明显差异，可能因为接种物取自以猪粪为发酵原料的沼气工程，猪粪和榨汁橙渣的理化特性差异导致其最适宜的细菌群落组成存在差异，而经过一轮发酵后的群落组成可能更适应榨汁橙渣的厌氧发酵。ISR 为2的沼渣在门水平和纲水平与其他处理的差异可能是因为起始接种物数量不足，发酵后期菌群已经失调。

WJD-0.75电动铲运机是武山铜矿井下主要采掘设备之一，承担南、北矿带大部分矿石及废石铲装任务。电缆托辊是电动铲运机运行时实现电缆顺利收放的装置［1］，但在使用过程中，由于电缆托辊磨损、轴承损坏或受到外部撞击，则需更换托辊。在实践更换时，维修难度大、维修时间长，特别是更换水平托辊时，还需多人配合才能完成，影响井下作业点正常生产组织。因此，通过对电动铲运机电缆托辊安装结构进行分析，提出了托辊支架的结构改进措施。

2.2.2古菌群落组成

由图5可知，接种物中主要存在4个属的产甲烷菌，分别是Methanosaeta、Methanosarcina、Methanospirillum和Methanobacterium，其相对丰度分别为72.58%、5.15%、16.06%和1.73%。其中，Methanosaeta和Methanosarcina同属于Methanosarcinales目，前者为专性乙酸营养性产甲烷古菌，后者则可以通过CO2还原、甲基裂解和乙酸发酵途径产甲烷[20]，而2/3甲烷的产量是来自乙酸的裂解[21]；Methanospirillum和Methanobacterium分属Methanomicrobiales和Methanobacteriales目，均为氢营养型产甲烷古菌[20]。发酵后古菌群落组成与接种物相比已经有所变化，在接种物中Methanospirillum的相对丰度较高，而Methanosarcina相对丰度较低，可能与发酵原料以及发酵系统中pH值有关，因为接种物取自以猪粪为发酵原料的沼气工程，猪粪的pH值较橙榨汁渣高，而变化后的古菌群落组成可能更适应榨汁橙渣的厌氧发酵。

图5 不同接种物量发酵前后古菌群落组成Fig.5 Composition of archaea community before and after anaerobic digestion

总体上看，Methanosaeta和Methanosarcina乙酸营养性产甲烷古菌的累积相对丰度随ISR的降低而提高，ISR为2条件下，这两个属的产甲烷古菌相对丰度达到90.17%。这与厌氧发酵系统中挥发酸的积累随ISR降低而提高的趋势一致，而Methanospirillum和Methanobacterium氢营养型产甲烷古菌的相对丰度随ISR降低而下降，ISR为2条件下，这两个属的产甲烷古菌相对丰度合计仅为6.92%。这可能与底物被大量转化为挥发酸，而这类古菌可利用底物量下降有关。

单独来看，乙酸营养性产甲烷古菌中Methanosaeta相对丰度随ISR降低而降低，Methanosarcina相对丰度随ISR降低而提高，在ISR为2条件下，相对丰度分别为24.45%和66.72%。这可能是因为前者最适生长的pH值范围(7.0～7.3)较后者(6.5～7.8)更窄[22]，而ISR为2的最低pH值达到6.57，不适宜Methanosaeta生长，而Methanosarcina仍能适应。同样地，氢营养型产甲烷古菌中Methanospirillum相对丰度随ISR降低而降低，Methanobacterium相对丰度随ISR降低而提高，在ISR为2条件下，相对丰度分别为1.71%和5.21%。这可能是因为前者的最适生长的pH值范围(7.0～7.8)较后者(5.6～8.6)更窄[22]。

2.3 接种物驯化对厌氧发酵的影响

厌氧发酵体系中微生物群落组成经过一轮厌氧发酵，已经得到了优化，这种改变的驱动力是发酵原料特性及厌氧发酵的条件[5]。为了进一步研究接种物驯化后对榨汁橙渣厌氧发酵效率的提升，待第1轮厌氧发酵停止后，在发酵装置中加入与第1轮相同的原料量进行第2轮发酵，在第2轮厌氧发酵停止后再加入相同原料量进行第3轮发酵，监测厌氧发酵的甲烷产量。

ISR为8和ISR为6的3轮厌氧发酵的甲烷累积产率见图6a。接种物驯化后甲烷累积产率没有得到进一步提高，说明驯化前的微生物数量是足够的，原料在发酵过程中被充分降解和利用。随着微生物对底物适应性的提高，产气效率在逐步提高，说明经过驯化，接种物对橙榨汁渣的适应性增强。ISR为8时第3、2、1轮甲烷累积产率分别为326.6、347.0、320.0 mL/g。从累积产甲烷量来看，虽然甲烷累积产率并没有表现出显著差异，但第3、2、1轮在前4 d产甲烷量占整个发酵周期产气量的95.75%、 83.78%和44.89%，通过接种物驯化，有效缩短了产气周期，提高了产气效率。ISR为6的第3、2、1轮甲烷累积产率分别为326.0、311.3、304.9 mL/g。虽然甲烷累积产率并没有表现出显著差异，但同样地，第3、2、1轮在前4 d产甲烷量占整个发酵周期产气量的93.40%、86.72%和38.03%，有效缩短了产气周期，提高了产气效率。ISR为8和6条件下，通过接种物驯化对厌氧发酵促进的效果是一致的，这也说明ISR为6下微生物数量相对榨汁橙渣量是充裕的，通过接种物驯化可以进一步提高厌氧发酵的效率，而ISR为6较ISR为8时添加较少的接种物，更具有应用价值。

图6 ISR为 8、6、4和2时3轮厌氧发酵甲烷累积产率Fig.6 Cumulative methane production of ISR 8, 6, 4 and 2 from the first to the third round

ISR为2的3轮厌氧发酵的甲烷累积产率见图6c。ISR为2的处理与ISR为4的第2个重复较为相似的是对厌氧发酵的提升也不显著，第3、2、1轮甲烷累积产率分别为136.6、117.2、111.4 mL/g。这说明在ISR为2条件下，第1轮发酵结束后微生物群落组成可能就失衡了，且为不可逆的，仅通过接种物的驯化不能促进榨汁橙渣的厌氧发酵。

采用修正Gompertz模型拟合的模型参数见表3。通过该模型可以很好地描述ISR为8和6的3轮厌氧发酵过程(R2>0.99)。从第1到第3轮，最大产甲烷速率Rmax逐步提高，反应停滞期λ在逐步缩小，其中第3轮ISR为8和ISR为6的Rmax分别达到了145.07 mL/(g·d)和139.32 mL/(g·d)，而λ缩短到0.27 d和0.26 d。模型的参数也体现出ISR为8和ISR为6并没有明显差异，而ISR为6更具有实际应用价值。对于ISR为4和ISR为2时，修正Gompertz模型只能很好地描述部分厌氧发酵实验(R2>0.99)，见表3，其中ISR为4 的第3轮比第2轮的Rmax进一步提高，λ进一步缩小，分别达到106.91 mL/(g·d)和0.32 d，表现出与ISR为8和ISR为6时一致的规律。

表3 修正Gompertz方程预测的榨汁橙渣厌氧发酵产甲烷动力学参数Tab.3 Model estimation results of OPR by modified Gompertz models

验证实验以夏橙榨汁渣为发酵原料，接种物经过一轮驯化，厌氧发酵结果见表4。ISR为8和6的甲烷累积产率分别为291.0 mL/g和298.5 mL/g，高于ISR为4和2的269.7 mL/g和208.1 mL/g，且ISR为8和6的产气周期也较ISR为4和ISR为2时短。这进一步验证了以橙榨汁废渣为原料开展厌氧发酵实验，宜采用ISR为6并将接种物驯化一轮。

表4 夏橙榨汁渣厌氧发酵结果Tab.4 Results of anerobic digestion of XC

3 结论

(1)ISR为8和6条件下，榨汁橙渣厌氧发酵可以正常进行，甲烷累积产率分别达到320.0 mL/g和304.9 mL/g，产气结束后发酵系统中细菌和古菌的群落组成也相似。同时，通过驯化优化微生物群落组成虽然不能提高甲烷累积产率，但可以有效缩短发酵周期，其中，ISR为6条件下第3、2、1轮发酵前4 d产甲烷量占总产量的93.40%、86.72%和38.03%，有效提高了发酵效率。开展榨汁橙渣中抑制成分在厌氧发酵中的代谢规律以及厌氧发酵的预处理优化等相关实验时，推荐选择ISR为6，并进行至少一轮接种物的驯化以避免因接种物数量和来源的差异对实验结果带来干扰。

(2)ISR为4条件下，接种物中微生物数量相对不足，不能充分利用底物，厌氧发酵效率低于ISR为8和6，累积甲烷产率也只有ISR为8和6的75.8%和79.6%。在该ISR下通过驯化接种物来促进厌氧发酵存在偶然性和不确定性，接种物中本身的微生物菌群落组成可能会更多地影响驯化的效果和质量。

(3)ISR为2条件下，接种物中微生物数量严重不足，厌氧发酵出现停滞，累积甲烷产率只有ISR为8和ISR为6的34.8%和36.5%，芽孢杆菌纲相对丰度下降到1.88%，Methanosaeta和Methanospirillum的相对丰度也分别下降到24.45%和1.71%，影响了甲烷的产生，且通过驯化接种物也无法改变微生物群落组成失调的状况。