安介导等温扩增法对虾酱中致病菌检测结果的分析

林青

（海南省食品检验检测中心，海南海口570314）

传统国标方法中食品的致病菌检测需要5～7天，对于海南博鳌年会或上海世博会等短期的会议活动而言检验时限太长，已经不能满足会议食品安全保障的需要。现今针对食源性致病菌快速检测的方法有：免疫磁珠法[1-3]、MALDI-TOF MS法[4]、恒温荧光 PCR法[5]、拉曼光谱法[6]、实时荧光定量PCR法[7]等。恒温荧光PCR全称是环介导等温扩增技术（LAMP），采用恒温扩增DNA技术，通过Bst聚合酶及特异性引物在恒温条件下对致病菌核酸片段进行特异性扩增，扩增后产物DNA与核酸染料结合发出荧光信号，最后根据所产生的扩增曲线判断结果。LAMP技术反应程序在63℃条件反应45～60min后可以将少量的靶核酸分子扩增到106分子水平。

本实验采用环介导等温扩增法快速检测海鲜制品虾酱中的沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌O157等5种常见致病菌。

1 材料与方法

1.1 材料

所有样品来源于送检样品。

1.2 试剂

细菌基因组DNA快速提取试剂盒、沙门氏菌核酸检测试剂盒、志贺氏菌核酸检测试剂盒、金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒、副溶血性弧菌核酸检测试剂盒、大肠杆菌O157核酸检测试剂盒购于广州迪澳生物科技有限公司。

1.3 仪器

MMK金属浴、Deaou-308C恒温荧光扩增仪（广州迪澳生物科技有限公司）。

1.4 检测方法

实验样品根据国家GB4789系列标准进行前增菌，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明提取模版DNA，将含有模版DNA的提取液加入核酸检测试剂盒中，同时加入阴性对照和阳性对照，然后上机检测。

图1

2 结果与分析

阴性和阳性对照结果正常，样品结果显示副溶血性弧菌疑似阳性，沙门氏菌、金葡菌及大肠杆菌O157等致病菌为阴性，详见图1。

对环介导等温扩增法检测出的副溶血性弧菌阳性样品按国标4789.7-2013方法检测检出温和气单胞菌、栖稻假单胞菌。针对环介导等温扩增快速检测显示致病菌阳性，而国标方法未检出这一情况分析存在以下可能：一是样品中可能存在一定量非存活的致病菌。致病菌不是活菌，因此常规检验不能被培养出来，但环介导等温扩增法的原理是在细菌DNA扩增的基础上利用荧光信号而显示结果，所以虽然是死菌，但仍然能被检出[8]。二是虾酱是高盐分产品，快速提取的DNA模板可能含有较高的离子浓度，从而影响PCR体系而导致出现了假阳性的可能。

3 结论

对于某些样品检验时应充分考虑样品特性，可选择多样的检测手段，防止假阳性结果的产生。作为一种新的技术手段恒温核酸扩增技术具有检测速度快、检测成本较低、检测时间短等优点，能加快传统方法检测致病菌的速度，满足食品快速通过的检验要求，值得推广使用。