不同清香型大曲理化生化指标和挥发性成分分析

马茹菲，马玉帛，佟世生，刘 萍

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.东北师范大学附属中学国际部，吉林长春130377；3.北京城市学院生物医药学部，北京100094）

白酒是我国传统的蒸馏酒，在中国文化和人们的日常生活中都扮演着重要的角色。白酒的流行一部分因素是由于其口味的多样性，根据香型可以将其分为浓香型、清香型和酱香型等[1]。白酒是以谷物（主要是高粱）为原料，通过发酵、蒸馏和贮存（陈酿）而制成。大曲是一种重要的糖化发酵剂，用于生产白酒和醋，对于产品风味的形成具有重要的影响[2-3]。大曲本身也是通过发酵而制成，大约需要1个月的时间，并进行6个月的成熟储存期[4]。

清香型白酒是我国最古老的酒种之一，具有清香纯正、醇甜柔和、自然协调、余味爽净的特点[5]。清香纯正即主体香乙酸乙酯与乳酸乙酯搭配协调，琥珀酸的含量也很高，无杂味，也可称酯香匀称，干净利落[6]。清香型大曲系用大麦、豌豆为原料制成，为我国古老曲种之一。制曲的目的主要是利用多种酶类的生化性能，使它变成我国独特形式的糖化剂和发酵剂。质量上乘的大曲是生产优质清香型白酒的关键所在，是最终形成白酒独特风格的决定因素。

“曲是酒之骨，好曲出好酒”，因此大曲在白酒酿造过程中起着非常重要的作用[7-8]。但是由于制曲过程中环境的高度开放性和不确定性等诸多不可控因素，使得酒曲品质缺乏统一性和稳定性。传统大曲的品质评定只局限于感官层面，但随着监测手段的发展和科学技术的进步，更多的理化指标和生化参数参与到了大曲质量的评定之中。基于此种情况，本研究以不同来源的清香型白酒大曲作为研究对象，分别从感官评价、理化参数、生化指标和挥发性成分等角度分别对几种样品大曲进行品质分析，为大曲评定标准的统一化和清香型白酒生产发酵剂的优化提供一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

6种不同来源的清香型大曲样品分别取自山西、江苏、四川和山东的当地酒厂，大曲均为红心、清茬、后火3种大曲混合而成。将采集得到的大曲粉碎后过40目筛，采用四分法混合均匀后于-20℃冰箱中保存备用。样品信息见表1。

表1 各样品名称及简称

1.2 实验方法

1.2.1 大曲的感官评定

大曲的感官品质可以依据外观、断面和香味等感官指标来初步描述。香味：将曲块折断后用鼻子嗅，是否香味扑鼻，无酸臭等其他异味。外观：是否灰白一片，无异色，穿衣均匀，无裂口，光滑。断面：是否灰白色一片，有较密集的菌丝生长，断面层次是否均匀等。

1.2.2 大曲中微生物分析

准确称取10 g大曲粉加入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，摇床充分振荡30 min，取1 mL加入到装有9 mL无菌生理盐水的试管中，得到10-2稀释液，依次操作得到10-3、10-4和10-5稀释液。吸取0.1 mL稀释液加入培养皿中，倒入温度适中的营养琼脂培养基、LB培养基、孟加拉红培养基和马铃薯琼脂培养基，摇晃混匀，待凝固后倒置，前两个放入35℃培养箱中，后两个放入30℃培养箱中，培养1～2 d后，分别对细菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌进行计数[9]。

1.2.3 大曲中理化和生化指标分析

大曲中的水分、淀粉、酸度、发酵力、液化力、糖化力和酯化力的测定参照行业标准《酿酒大曲通用分析方法》[10]。标准规定，水分含量以百分比表示；淀粉含量为每100 g大曲中含有淀粉的质量，单位为g/100 g；酸度为10 g绝干大曲消耗0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的毫摩尔数，单位为mmol/10 g。发酵力表示为在30℃下，72 h内0.5 g大曲利用可发酵糖类所产生的二氧化碳克数为一个发酵力单位，以（g/0.5 g·72 h）表示；液化酶活力表示为在35℃、pH4.6条件下，1 g绝干曲1 h能液化淀粉的克数为一个液化力单位，符号为U，以U/g表示；糖化力表示在35℃、pH4.6条件下，1 g绝干曲1 h转化可溶性淀粉生成葡萄糖的毫克数为一个糖化力单位，符号为U，以U/g表示；酯化酶活力为每50 g大曲在35℃下，经过7 d催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的毫克数为一个酯化力单位，符号为U，以U/50 g表示。

蛋白酶活力测定方法参照国家标准SB/T 10317—1999。酶活定义：在40℃条件下，1 g大曲每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个蛋白酶活力单位，以U/g表示。

纤维素酶测定方法采用DNS法[11]，酶活定义：在50℃，自然pH值条件下，1 g大曲每分钟催化纤维素水解生成1 μg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位，以U/g表示。

1.2.4 大曲的挥发性成分分析

参考Ding等[12]使用的方法：准确称取1.00 g大曲样品放入顶空瓶中，再加入20 μL 2-辛醇甲醇溶液 (0.82 g/L)，盖上瓶盖。取 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在磁力搅拌器上插入加有20 μL 2-辛醇甲醇溶液和1.00 g大曲的顶空瓶，萃取温度60℃，顶空吸附45 min，再插入温度为250℃的气质联用仪上解吸5 min后进行检测。

气相色谱条件：氦气作为载气，流速控制为1 mL/min；升温程序：起始温度40℃，维持5 min，以5℃/min升至220℃，维持5 min；气化室温度为250 ℃；分流比为10∶1。

质谱条件：选择电子轰击电离离子源（EI），电子能为70 eV，离子源温度为230℃，质量范围控制在40～400 u。

利用保留系数对挥发性组分进行定性分析，并计算各样品中各类挥发性组分的相对丰度。

1.2.5 统计分析

所有样品重复做3次平行，结果表示为平均值±标准偏差。使用方差分析(ANOVA)对不同样品中微生物数量和理化生化指标等进行显著性分析（P＜0.05）。所有统计分析均使用SPSS 20.0和Excel 2013。

2 结果与讨论

2.1 不同大曲感官特征的评定

对于大曲的判定标准，在外观方面主要表现为外观、断面和香味等指标，本实验选择了6种不同来源的清香型大曲样品，对其感官特征进行分析比较，结果见表2。

从外观角度比较，FJ、TY大曲样品色泽单一无杂色，菌丝均匀整齐，无裂口；从断面角度比较，FJ、TY和XY大曲样品无论是色泽还是泡气程度等性状都比其他样品好；FJ、TY、XY大曲样品在香气上也表现出浓郁且无杂味的良好特征，而JS、SC、SD这3种大曲的曲香表现为淡薄且夹杂轻微异味。

2.2 不同大曲主要微生物的种类和数量分析

不同清香型大曲样品的细菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母菌数量见表3。

表3反映了大曲中细菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母菌的数量与感官评定之间的关系。TY大曲样品中细菌和芽孢杆菌的数量相比于其他样品均较高，其中芽孢杆菌的数量分别是来自相同区域的FJ和XY数量的3倍左右，而芽孢杆菌与大曲的曲香有一定的相关性。表中FJ、TY、XY 3种样品相比于其他样品在霉菌数量方面差异显著，高出近一个数量级。感官评价的结果显示，FJ、TY、XY 3种大曲的“穿衣”均优于其他大曲，大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生长好坏的外在表现特征，由于霉菌在生长繁殖过程中可产生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶类，所以霉菌的生长繁殖状况对各种酶活力有很大的影响，即大曲穿衣是评定大曲质量的一个重要标准[13]。

2.3 不同大曲理化成分分析

衡量大曲的理化性质，可以用水分、淀粉含量、酸度以及蛋白质含量等理化成分指标进行比较，分别测定6种清香型大曲的相关指标，结果见表4。

表2 对不同清香型大曲的外观、断面和香味等感官特征的比较

表3 6种清香型白酒大曲中微生物数量比较(log cfu/g)(n=3)

成品大曲的水分表征了大曲所含水分的多少，随贮藏时间的延长，大曲的水分含量逐渐减少，表明发酵产生的游离水越多，挥发能力强，大曲的成熟度更佳。根据制曲车间成品大曲出厂检验标准的相关规定，大曲中的水分含量不能超过总质量的13%，根据表4结果显示，几种样品大曲水分含量均合格。

在制曲过程中，曲块发生了复杂的发酵过程，而大曲的酸度正是由曲块中的蛋白质、脂肪等产酸微生物进行有机代谢产生，大曲酸度是反映大曲微生物的新陈代谢和评定大曲质量的重要指标。表3反映出TY大曲样品酸度明显高于其他样品，其余大曲酸度含量也有所差异，但与白钢等[14]的研究结果基本相同，其揭示出不同大曲样品中产酸微生物的数量有较大差异[15]。分析表4可知，SD、JS大曲样品淀粉含量相对较高，大曲中淀粉含量与其糖化酶和液化酶活性关系密切，在制曲过程中，制曲微生物产生的糖化酶和液化酶活性越高，显著地表现出对淀粉原料的降解和消耗。在蛋白含量方面几种大曲样品同样表现出明显的差异，其中SD样品中蛋白质含量高达24.26 mg/g，而SC样品中蛋白质含量只有8.76 mg/g。

2.4 不同大曲发酵力和酶活力比较

大曲的发酵力和酶活力是反映大曲品质的重要生化指标，比较不同大曲样品的发酵力以及液化酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶和酯化酶等5种酶活力的情况，结果见表5。

二氧化碳的失重表征了大曲的发酵力，6种大曲的发酵力情况见表5。由表5可看出，不同清香型大曲样品的发酵能力不同。其中XY、TY、JS和FJ样品发酵力均较强，表明其中微生物的生长代谢和繁殖的速度较快。

大曲中的酶系是分解大曲中淀粉和蛋白质等原料的动力，分解产物为微生物的新陈代谢提供物质基础。表5显示，几种大曲中液化酶活力较小，均保持在0.5～1.1 U/g的范围内。大曲中微生物尤其是霉菌的生长繁殖状况与液化酶活力有紧密的联系，从实验结果可以看出，FJ、TY大曲样品液化酶活力相对较高。糖化酶活力差异较为显著，高低差异可达4倍，最高者为XY大曲样品，为502.1 U/g，最低者SC大曲样品同时也是液化酶活力最低。6种大曲的蛋白酶活力也有明显差异，其中XY、FJ大曲样品中蛋白酶活力大于100 U/g。曲霉、毛霉、根霉和芽孢杆菌广泛存在于大曲中，这些产蛋白酶微生物的生长繁殖状况是大曲中蛋白酶活力高低的关键因素[16]。蛋白酶可分解蛋白质生成氨基酸，氨基酸能够参与美拉德反应生成风味物质，有利于促进大曲风味前体物质的形成；蛋白酶活力越高，曲香表现越浓郁，这与大曲感官评定中的香味判定标准相一致。FJ、TY大曲样品的纤维素酶活力高于其他样品，纤维素酶在白酒酿造中起着重要的作用，它能够将纤维素类原料降解为微生物可利用的糖类，提高对原料的利用率。TY大曲样品中酯化酶活力明显较高，大曲中的酯类化合物与大曲风味的形成密切相关，大曲的酯化酶活力是催化产生这些酯类化合物的动力，酯化酶活力越高则大曲在发酵过程中产生的酯类化合物越多，这有利于促进白酒风味的形成[17]。

表4 几种清香型白酒大曲理化成分

表5 不同清香型大曲发酵力和酶活力比较

2.5 不同大曲挥发性成分分析

6种不同的大曲样品共检出了78种挥发性组分，根据其化学结构特点，分为醇类（9）、酸类（3）、酯类（17种）、醛类（4）、酮类（8）、烷类（19）、其他类（18）组分。各样品中挥发性组分种类及所占比例分别见图1和图2。

图1 各样品中挥发性物质的种类

图2 各类挥发性组分在各样品中所占的比例

从图1和图2可以看出，不同清香型大曲样品中挥发性成分的种类和相对丰度有所差异，其中醇类、酯类、酮类、醛类和烷类为含量相对较高的化合物。化合物种类的数量一定程度上体现了大曲样品中微生物的代谢情况。在FJ、TY、XY、JS、SC、SD大曲样品中分别检测到31种、34种、41种、20种、25种、24种物质，说明FJ、TY、XY大曲样品中挥发性成分更复杂。其中FJ样品中检测到最多种类的醇类和酮类，XY样品中检测到最多种类的酯类和烷类。综合检测结果发现，FJ、TY、XY样品挥发性成分丰富，这与感官评价中曲香较浓郁的结论相一致。

从化合物种类角度分析，较高含量的醇类是大曲微生物代谢的前体物质，醇类是形成酯类的重要物质基础，而酯类和芳香族化合物又构成了大曲的独特曲香。醇类主要由酵母在有氧条件下利用糖发酵生成，而在厌氧条件下通过氨基酸生成，或者由酵母利用相应的醛通过化学还原反应形成[18]。高级醇含量可以在一定程度上反映大曲中酵母菌的代谢情况。

酯类是挥发性成分中较为重要的呈香物质，其中大曲中的部分酯类物质也会进入到大曲酒中形成酒中独特的风格。其中白酒中的酯类物质主要包括两大类，分别是乙酸酯和乙醇酯。乙醇酯是由乙醇和其他有机酸在相应酶的催化下脱水缩合而成；而乙酸酯则是由除乙醇外的醇类物质在催化条件下合成。在样品大曲中检测到多种酯类，酯类化合物一般具有水果等令人愉悦的芬芳香气，对白酒独特风味和品格的形成具有重要作用。

脂肪酸类物质的来源既包括产酸细菌的代谢也包括真菌的代谢，脂肪酸类物质同样是形成酯类的前体物质，同时在白酒中产生特定的香味或酸腐味，很大程度上影响着白酒的口感。大曲中醛酮类物质可由微生物降解大曲原料中的淀粉类物质，在糖酵解过程中尤其是在酵母的作用下产生。它们与大曲中的酯类物质共同构成了大曲的独特曲香，并且酮类和醛类也会通过发酵进入大曲酒中，作为微生物代谢的前体物质参与酒香的形成。

3 结论

本研究从感官特征、微生物指标、理化生化指标和挥发性成分等方面出发，选取不同地区的6种清香型大曲进行了品质分析。结果表明，在感官特征（外观、断面、香味）方面，FJ、TY、XY这3种清香型大曲样品菌丝均匀，色泽灰白良好，泡气整齐，曲香浓郁，其他3种样品感官评价较差。在微生物方面，不同样品中细菌、芽孢杆菌、霉菌和酵母菌的数量差异明显，其中FJ、TY、XY样品大曲中微生物数量较多，微生物尤其是霉菌数量的不同与大曲的感官特征关系密切，同时也是其代谢产生酶系活力差异的重要原因；在理化指标方面，大曲样品水分含量适宜，FJ、TY、SC大曲样品自身淀粉的消耗较多，同时TY大曲酸度显著高于其他样品；对生化酶活性分析结果表明，FJ、TY、XY大曲有较好的发酵能力，液化力、糖化力、酯化能力都较强；在挥发性成分方面，醇类、酯类、酮类、醛类和烷类为大曲样品中含量相对较高的化合物，其中在FJ、TY、XY样品中检测到较多的挥发性成分，这与感官评价中曲香较浓郁的结论相一致。要建立较准确的大曲质量标准，需综合感官指标、微生物指标以及理化生化指标等多个参数共同进行评定，还需要进一步研究各个指标对酿酒品质的影响程度，重新对其进行权衡，制定出行业统一标准，从而帮助推动制曲专业化的进一步发展。