乳酸脱氢酶A在不同分级胃肠胰神经内分泌肿瘤中的表达及意义

胃肠胰神经内分泌肿瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors，GEP-NETs）是一组罕见的高度异质性肿瘤，发病率为3.56/100 000，占神经内分泌肿瘤的70%，目前在消化道肿瘤中居第2位[1-2]。由于肿瘤的异质性和非特异性临床表现，多于体检过程中偶然发现。尽管其发病率升高，但其相关临床及分子机制的研究尚不足。

乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）是糖酵解的关键酶之一，可促进丙酮酸生成乳酸。研究发现，LDHA在乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中表达水平上调[3-5]。此外，沉默或抑制LDHA 可抑制肿瘤生长和转移[6-7]。上述研究提示LDHA 在肿瘤发生发展中发挥重要作用。目前对LDHA 与GEP-NETs 关系的研究及生存预后的影响尚且不足。

本研究通过免疫组织化学方法检测112例不同分级GEP-NETs组织中的LDHA表达差异，通过分析临床病例资料及患者预后随访信息，探讨LDHA表达在GEP-NETs临床诊治中的意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取青岛大学附属医院2013年1月至2018年12月经内镜及手术切除的GEP-NETs病例112例，纳入患者经病理确诊，术前未接受放疗、化疗及激素治疗且临床病理资料完整。其中男性76例，女性36例；年龄≤60岁为46例，＞60岁为66例；胃部肿瘤66例，肠27例，胰腺19例。按照2019年世界卫生组织（WHO）消化系统肿瘤分类方案[8]，根据其Ki-67增殖指数及核分裂像分级，G1级为43例，G2级为17例，G3级为52例。本研究通过青岛大学附属医院伦理委员会审核批准，并获得患者及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法 将符合纳入标准的石蜡包埋组织切片为4 μm，采用PV-6000法行免疫组织化学检测LDHA蛋白表达。二甲苯脱蜡，梯度酒精溶液复水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，以1:300稀释，37℃恒温孵育1 h，缓冲液冲洗，二抗反应，再次缓冲液冲洗，DAB显色，苏木素复染，切片脱水，中性树胶封片，显微镜下判读。LDHA兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology（CST）公司；一抗稀释液、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）浓缩试剂盒等均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2.2 免疫组织化学结果判读 LDHA 为浆阳性表达，胞浆内出现黄至棕黄色颗粒为染色阳性表现。以阳性细胞百分率×染色强度进行评分。以缓冲液替代一抗为阴性对照。细胞阳性百分率评分：无阳性细胞数为0 分，阳性细胞数＜10%为1 分，10%～50%为2 分，51%～80%为3 分，＞80%为4 分；染色强度评分：细胞未染色为0分，轻度染色为1分，中度染色为2 分，强染色为3 分；计算得分，0～3 分为低表达，＞3分为高表达。最终乘积得分范围为0～12分，＜4 为低表达，≥4 为高表达。每张切片随机选择10个高倍镜视野，分别由两名病理科医师对进行独立阅片评分，取平均值，结果有差异者重新评分。

1.2.3 随访 通过门诊及电话对患者进行随访，随访时间截至2019年5月，生存时间为手术当日至末次随访时间或患者死亡日期。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以x±s表示，计数资料以例数及构成比表示，相关性分析采用Pearson χ2检验或Fisher确切概率法；Kaplan-Meier生存曲线进行单因素生存分析，Cox回归行多因素生存分析；Log-rank检验进行生存分析组间比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GEP-NETs组织中的LDHA表达

LDHA 呈胞浆表达，染色呈棕黄色或棕褐色（图1）。在112例患者组织中，32例呈低表达，80例呈高表达，表达阳性率为71.43%（80/112）。其中，G1级阳性表达率为48.8%（21/43），G2级为70.6%（12/17），G3级86.5%（47/52）。LDHA 在G1～G3级GEP-NETs 中的表达差异具有统计学意义（χ2=19.915，P＜0.05）。

2.2 LDHA 表达与GEP-NETs 患者的临床病理特征的关系

GEP-NETs 男性患者的LDHA 表达情况与女性患者之间差异具有统计学意义（χ2=9.043，P=0.003）；肿瘤最大直径≥3 cm的LDHA 高表达水平较直径＜3 cm 者差异有统计学意义（χ2=5.164，P=0.023）；LDHA高表达在浸润深度、TNM 分期及淋巴结转移中的差异具有统计学意义（χ2=15.120、16.804、14.316，均P＜0.001）。患者年龄、肿瘤位置、是否伴有远处转移与LDHA 表达无相关性（均P＞0.05）。此外，组织中LDHA的表达与血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）表达量及经典神经内分泌标志物突触素（synaptophysin，Syn）、嗜铬粒蛋白A（chromogranin A，CgA）的表达无相关性（均P＞0.05）（表1）。

图1 LDHA在不同分级GEP-NETs组织的表达情况

表1 GEP-NETs组织LDHA表达与患者临床病理特征的关系

2.3 LDHA表达与GEP-NETs患者的生存分析

112例GEP-NETs患者随访时间为1～69个月，中位随访时间为48个月。单因素生存分析显示，病理分级、淋巴结转移、远处转移、血清LDH及TNM分期与较差的生存预后相关（均P＜0.001，图2）。将对单因素分析有意义的指标进行Cox回归分析，结果显示肿瘤病理分级（P=0.001；HR=0.064，95%CI：0.013～0.307）、远处转移（P=0.006；HR=0.326，95%CI：0.146～0.729）及LDH（P＜0.001；HR=0.106，95%CI：0.035～0.325）是提示患者预后差的独立预后因素（图2A～E）。按照LDHA在组织中的表达情况分为高表达组和低表达组，采用Kaplan-Meier法分析LDHA表达情况与患者生存率的差异（图2F）。高表达LDHA患者生存结果较低表达LDHA患者差，Log-rank检验显示差异具有统计学意义（χ2=8.026，P=0.005）。

3 讨论

GEP-NETs 较腺癌患者相比，生存期相对较长，但生存质量不佳，易发生转移，常见转移部位为肝脏，预后差[9]。目前针对GEP-NETs的发病机制及侵袭转移的研究较少。本研究根据增殖指数及核分裂像数对纳入GEP-NETs病例进行分类，包括G1级和G2级神经内分泌瘤、G3级神经内分泌癌。由于混合性神经内分泌-非神经内分泌瘤（mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasm，MiNEN）构成成分的多样性和复杂性，且同一肿瘤内的不同成分分级不同，故将MiNEN病例排除。GEP-NETs病理分级与患者预后及治疗相关，进一步探讨不同分级GEPNETs 临床病理特征等相关内容，对临床治疗发挥重要指导作用。

LDHA通过催化无氧糖酵解最后一步，在调节糖酵解过程中发挥重要作用，其表达上调有利于提高肿瘤细胞的无氧糖酵解效率，降低肿瘤细胞对氧的依赖性。多项研究提示，LDHA在肿瘤组织中的表达较正常组织升高，包括胆管癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌等，并提示预后不佳[10-13]。本研究通过免疫组织化学方法检测到不同分级的GEP-NETs中LDHA的表达差异。肿瘤分级越高，LDHA的表达阳性率也越高。提示LDHA表达或可与GEP-NETs增殖及肿瘤进展相关。通过进一步进行临床病理特征分析发现组织LDHA表达水平与患者性别、肿瘤大小、TNM分期、浸润深度及淋巴结转移相关，其高表达提示患者生存结果较差。

血清LDH水平是结直肠癌、肺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤的预后指标[14]。Koukourakis 等[15]发现，在71%的LDHA 阳性表达大肠癌病例中，血清LDH水平与组织LDHA 水平无相关。虽然低LDHA 在肿瘤特异性中的表达与低血清LDH 水平相一致（＜450 U/L），但在高LDHA 水平表达中，只有29%患者血清LDH＞450 U/L。本研究中，仅8例患者血清LDH 升高，其中，血清LDH 升高患者中组织LDHA高表达者占87.5%（7/8）。由于病例数相对较少，且患者血清LDH的正常水平差异较大等原因，可能会出现血清LDH 升高而检测值处于正常范围的情况。Koukourakis 等[16]认为血清LDH 水平与肿瘤负荷相关，而LDHA 表达是在原发肿瘤中进行评估的，故两者缺乏显著相关性。在本组病例的GEP-NETs中，肿瘤直径≥3 cm组织LDHA 高表达且伴血清LDH 高表达者占75%（6/8）。Lamarca等[17]通过队列研究将LDH作为评估胃肠神经内分泌癌预后的因素之一，提示其可预测总体生存期。这表明血清LDH 和组织LDHA表达水平两者互补，联合使用可能更好地表达肿瘤中LDH 活性谱[16]。CgA 和Syn 是神经内分泌肿瘤病理诊断的必要指标，本研究发现组织LDHA表达水平与经典神经内分泌标志物无相关性，但或可作为补充检测指标，为GEP-NETs生存预后提供预测价值。

图2 112例GEP-NETs患者生存分析

多种肿瘤组织中LDHA高表达与肿瘤的侵袭、转移和预后不佳相关。本研究中，伴淋巴结转移者组织LDHA表达较无转移者明显升高，提示LDHA参与GEP-NETs 患者淋巴结转移，且提示预后不佳。LDHA可为细胞提供能量，当LDHA在细胞中表达受到抑制时，三磷酸腺苷产生减少，细胞生长变缓。LDHA 表达受抑，会诱导活性氧产生，引起线粒体损伤，最终导致细胞凋亡。活性氧的累积还可导致线粒体原肌球蛋白结构改变，进而导致肌动蛋白重构能力受损，最终导致肿瘤转移受抑[18]。LDHA导致细胞乳酸分泌增加是其调控细胞侵袭及转移的另一重要机制。高浓度乳酸与肿瘤的早期远处转移相关，乳酸通过改变细胞微环境、影响基质金属蛋白酶、组织蛋白酶、血管内皮生长因子及缺氧诱导因子-1α等发挥作用[19-20]。此外，乳酸可通过调节肿瘤细胞微环境，抑制免疫监测，促进肿瘤的发生发展[21]。上皮间质转化也是LDHA 促进肿瘤转移的基础之一。Zhao等[22]研究表明，LDHA 通过促进肾细胞癌上皮-间质转化促进肿瘤转移，且与E-钙黏蛋白表达呈负相关，与N-钙黏蛋白呈正相关。本研究中，LDHA 表达量与患者TNM分期及淋巴结转移相关，可能提示LDHA参与神经内分泌肿瘤的转移。本研究同时发现，LDHA 在不同分级GEP-NETs 中的表达与患者生存期较低相关，具体作用机制及其诊治价值有待进一步探究。

综上所述，LDHA在GEP-NETs组织中的表达与肿瘤分级相关，分级越高，其表达越高，且其高表达预示患者预后不佳。此外，LDHA的表达与患者性别、肿瘤大小、TNM 分期、浸润深度及淋巴结转移存在相关性。由于肿瘤的高度异质性，LDHA在GEP-NETs不同病理类型以及在侵袭及转移中的具体作用机制有待进一步研究。