GC-MS法测定盐酸金霉素眼膏中16种多环芳烃含量

肖钦钦 刘绪平 段和祥 陈希 张银花

(江西省药品检验检测研究院，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，南昌 330029)

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指分子中含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物的总称，是重要的环境和食品污染物，具有很强的致畸、致癌和致突变性。PAHs可以通过呼吸或者直接的皮肤接触使人体致癌。1979年美国环保总署(EPA)列出的129种优先监控的污染物中有16种为PAHs，1982年EPA《城市和工业废水的有机化学分析方法多环芳烃的测定》(METHOD 610)中引入16种PAHs的清单[1]。我国第一批68种优先控制的污染物中也将7种多环芳烃列入其中[2]。欧洲议会和欧盟理事会发布的第2005/69/EC号指令及REACH法规附件X Ⅶ50均对用于轮胎生产的填充油中的苯并[a]芘及8种PAHs的总含量进行了限量规定[3-4]。德国2011年11月29日修订后的ZEK 01.4-08《GS认证过程中PAHs的测试和验证》也对18种PAHs制定了具体限量指标[5]。由于苯并[a]芘是首个被发现的环境化学致癌物，而且致癌性很强，故常以苯并[a]芘作为多环芳烃的代表，它占全部致癌性多环芳烃的1%～20%。

盐酸金霉素眼膏处方中99.5%为辅料凡士林和液状石蜡，它们均是从石油中得到的多种烃的半固体或液态混合物，易含有多环芳烃等杂质。眼膏剂涂于眼睛患处，直接与人体皮肤黏膜长时间接触，多环芳烃类物质超标，将严重危害人类身体健康。本研究采用GC-MS法分析盐酸金霉素眼膏中是否有污染PAHs的风险，通过对辅料中16种PAHs含量的测定及对制剂生产工艺的模拟，探讨导致制剂中PAHs异常的原因，为该类剂型的安全性评估提供数据支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

7890B-7000C气相色谱质谱联用仪(Aglient公司)，Sartorius BS200S电子天平(Sartorius公司)，N-EVAP24氮吹仪(Organomation公司)，10mL具塞刻度试管。

1.2 试药

盐酸金霉素眼膏为2018年国家评价性抽验样品，共210批，涉及5个生产企业。辅料凡士林和液状石蜡为其中4个制剂企业提供，各1批。

16种多环芳烃标准混合溶液：萘(nahpthalene,1001μg/mL)，苊烯(acenaphthylene, 1998μg/mL)，苊(acenaphthene, 995.9μg/mL)，芴(fluorene, 200.1μg/mL)，菲(phenanthrene, 100.2μg/mL)，蒽(anthracene,100.2μg/mL)，荧蒽(fluoranthene, 200.1μg/mL), 芘(pyrene, 99.84μg/mL)，苯并[a]蒽(benzo[a]anthracene,100.4μg/mL)，䓛(chrysene, 100.6μg/mL)，苯并[b]荧蒽(benzo[b]fluoranthene, 200.1μg/mL)，苯并[k]荧蒽(benzo[k]fluoranthene, 100.4μg/mL)，苯并[a]芘(benzo[a]pyrene, 100.7μg/mL)，茚并[1,2,3-cd]芘(indeno[1,2,3-cd]pyrene, 99.96μg/mL)，二苯并[a,h]蒽(dibenz [a,h]anthracene, 199.9μg/mL)，苯并[g,h,i]苝(benzo[g,h,i]perylene, 200μg/mL)，溶剂为甲醇:二氯甲烷=1:1；正己烷、乙腈均为色谱纯。

2 实验方法

2.1 溶液配制

混合标准储备液：移取16种PAHs标准混合溶液0.5mL置于100mL量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，作为标准储备液，密封，低温避光保存。

供试品溶液：取盐酸金霉素眼膏混匀，精密称取混合均匀的试样1.0g，置于10mL具塞刻度试管中，加正己烷6mL，振荡摇匀使溶解，2000r/min离心5min后取上清液3mL至另一10mL具塞刻度试管中，加正己烷饱和的乙腈3mL，振荡提取1min，收集乙腈层。再用正己烷饱和的乙腈按上述步骤提取2次，合并乙腈层，涡旋混匀，再氮吹至少于1mL，再加乙腈定容至1mL，即得(必要时可适当稀释)。

2.2 分析条件

2.2.1 气相色谱条件

色谱柱DB-5MS毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm)；载气：高纯氦气(纯度大于99.999%)，柱流速：1.0mL/min；进样口温度：250℃；进样体积：1.0μL，不分流进样；程序升温：初始温度：90℃，以20℃/min升温至220℃，再以5℃/min升温至320℃，保持2min，共计28.5min。

2.2.2 质谱条件

离子化方式：电子轰击离子源(EI)；电离能量70eV；碰撞气：高纯氩气(99.999%)；离子源温度230℃；色谱-质谱接口温度280℃；溶剂延迟时间3min；数据采集模式：选择离子监测模式(SIM)。监测离子信息详见表1。

2.3 方法学验证

表1 16种多环芳烃的保留时间与特征离子信息Tab.1 The informations of retention time and characteristic ions for the determination of PAHs

2.3.1 线性试验

分别移取混合标准储备溶液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、10.0、2.0和5.0mL，依次至100、100、100、100、100、100、100、10和10mL量瓶中，再加乙腈稀释并定容至刻度，摇匀，配成一系列浓度的混合标准曲线溶液①～⑨。分别精密量取上述系列混合标准曲线溶液①～⑨与混合标准储备液⑩各l.0μL，按“2.2”项下条件进行分析。以定量离子的峰面积A为纵坐标，浓度c为横坐标，进行线性回归。结果表明16种PAHs在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.993，回归方程和相关系数见表2。

2.3.2 检出限和定量限

取上述混合标准曲线溶液逐步稀释后精密吸取各溶液1μL，注入GC-MS仪，记录质谱图。各组分以在定量离子图谱中信噪比满足1:3为检测限(LOD)，以在定量离子图谱中信噪比满足1:10为定量限(LOQ)，测得16种PAHs的检出限和定量限如表2所示。

2.3.3 空白实验

用正己烷替代样品，按“2.1”项下供试品溶液的制备方法，制备试剂空白。精密量取试剂空白和标准混合溶液1μL注入GC-MS仪，按“2.2”项下条件进行分析，记录质谱图。标准混合溶液的GC-MS图谱见图1，从GC-MS质谱图中各物质的保留时间及定量、定性离子丰度比结果可以看出试剂空白溶液中含有少量菲和荧蒽(响应为1725和490)，从线性回归方程可以看出，两种物质的标曲截距值(1944和1154)均大于试剂空白中上述成分的响应值，即可以忽略试剂空白中上述两种成分带来的干扰。

表2 16种PAHs线性回归方程、LOD和LOQTab.2 Linear regression equations, LODs and LOQs of PAHs

图1 混合标准溶液GC-MS图谱Fig.1 Representative MRM chromatograms from the maxed reference standards solution of 16 PAHs

2.3.4 准确度和重复性

取混合均匀的空白试样1.0g两份，分别置于10mL具塞刻度试管中，加正己烷6mL，振荡摇匀使溶解，2000r/min离心5min后分别取上清液3mL至另两支10mL具塞刻度试管中，分别加混合标准曲线溶液⑤和⑦各1mL后，再加正己烷饱和的乙腈2mL，振荡提取1min，收集乙腈层。再用正己烷饱和的乙腈按上述步骤提取2次，合并乙腈层，涡旋混匀后再氮吹至少于1mL，再补加乙腈至1mL，作为回收待测溶液“(1)”和“(2)”，各平行制备6份。

测得16种PAHs的平均回收率为72%～118%，回收率的RSD为0.5%～2.5%，表明本方法准确度和重复性结果良好。

2.4 样品测定

采用本研究建立的16种PAHs的GC-MS检测方法，对210批盐酸金霉素眼膏、4批凡士林和4批液状石蜡进行检测，结果详见表3～4。实验结果发现盐酸金霉素眼膏中均未检出苊烯、芴、苯并[k]荧蒽和二苯并[a,h]蒽这4种成分，而萘、菲、芘、苯并[g,h,i]苝4种成分检出率较高，最高检出率达85%。在检出成分中，苊、蒽、荧蒽、苯并[a]蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘这7种成分检出含量最高值均小于0.5mg/kg，总PAHs含量均小于10mg/kg。检出率最高的成分为苯并[g,h,i]苝，其检出含量最高值为5.7mg/kg，含量大于0.5mg/kg的样本共40批次，涉及生产企业及批次分别为厂家A 36批次、厂家G 2批次、厂家D和F各1批次。

凡士林和液状石蜡均检出菲，液状石蜡均未检出苯并[g,h,i]苝，而凡士林均检出，其中厂家A所提供的凡士林检出苯并[g,h,i]苝含量最高，超出其他厂家3倍。

2.5 生产工艺模拟试验

盐酸金霉素眼膏生产中，凡士林需在约160～170℃加热120min进行灭菌，由于多环芳烃类物质在高温条件下可能经热聚反应产生，从而导致产品中苯并[g,h,i]苝含量异常偏高。针对这一可能性，本研究设计了凡士林灭菌模拟试验，即将制剂生产企业提供的凡士林置于160℃烘箱中分别加热0、2和4h，检测凡士林在加热过程中是否会导致苯并[g,h,i]苝含量明显升高。实验结果见图2所示，凡士林经160℃加热2h后苯并[g,h,i]苝含量相对有所升高(最大上升26%)，但相对制剂中的苯并[g,h,i]苝含量，该变化并不明显，说明生产工艺并不是导致产品中苯并[g,h,i]苝含量异常偏高的主要原因。

3 讨论

在德国2015年7月1日实施的GS产品认证PAHs管控要求中，对第2类其他类产品中PAHs的限度规定，与皮肤长时间接触(超过30s)的材料其苯并[g,h,i]苝限值应小于0.5mg/kg[6]。本研究发现国产盐酸金霉素眼膏中苯并[g,h,i]苝含量超过0.5mg/kg的样品较多，超限率达18%，平均含量为3.8mg/kg，存在较大质量风险。针对部分企业生产的盐酸金霉素眼膏中检出苯并[g,h,i]苝含量异常偏高的情况，分析其原因可能主要为辅料质量较差所致。鉴于从辅料凡士林中均检出苯并[g,h,i]苝，其中来源于厂家A的黄凡士林检出的苯并[g,h,i]苝含量远较其它厂家高；而在液状石蜡中苯并[g,h,i]苝均未检出，提示直接影响盐酸金霉素眼膏质量及安全性的关键因素是辅料凡士林的优劣。此外，模拟试验证明，不恰当的生产工艺可能导致制剂中苯并[g,h,i]苝含量增加，但不是异常偏高的主要原因。

表3 盐酸金霉素眼膏多环芳烃含量测定结果Tab. 3 Results of the determination of PAHs in chlortetracycline hydrochloride eye ointment

表4 辅料多环芳烃含量测定结果Tab.4 Results of the determination of PAHs in excipients

图2 凡士林中苯并[g,h,i]苝含量随高温加热时间变化趋势Fig.2 Trends of the content of benzo[g,h,i]perylene in vaseline with the time of heating

鉴于多环芳烃类物质存在致畸、致癌、致突变等3大主要危害，虽然目前国内还未对药品中多环芳烃的污染限量有相关的规定，对广泛使用凡士林为辅料的眼膏剂、软膏剂中的PAHs进行限值规定，并进行安全评估有重要的意义。