玉米骨干自交系对除草剂苯磺隆和甲咪唑烟酸的敏感性差异

刘 才，王作平，杨梦婷，张中保，邹华文，吴忠义

(1.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025; 2.北京市农林科学院/北京农业生物技术研究中心/农业基因资源与生物技术北京市重点实验室，北京 100097)

玉米是我国第一大作物，年种植面积超3 000万hm2[1]。玉米的高产和优质是粮食安全的重要保证。在玉米整个生长过程中，杂草会与其争夺阳光、营养水分及生长空间，严重影响玉米的正常生长，造成玉米产量下降。同时，杂草滋生阻碍了田间通风透光,使得玉米很容易滋生病虫害，严重影响玉米的产量及品质[2]。为了保证单位面积上的粮食产量，各种除草剂相继被开发，粮食生产率由此得以大幅度提高。除草剂的使用也极大地减小了劳动强度，提高了农业生产水平[3]。

磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂是具有代表性的乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase，ALS)抑制剂类除草剂，具有高效、低毒、广谱、选择性强等优良特性。磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂均通过抑制ALS活性，阻断支链氨基酸合成而达到杀除杂草的目的，对人和哺乳动物毒性低，在农业生产中得到了广泛的应用[4]。其中，苯磺隆和甲咪唑烟酸是较为常用的磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂。张金林等[5]在室内用苯磺隆、甲磺隆和绿磺隆对玉米种子进行抑制试验，根长测定结果表明，玉米胚根是比较敏感的试验材料。苏旺苍等[6]研究了玉米不同部位对甲咪唑烟酸的敏感性，结果表明，甲咪唑烟酸对玉米根长、株高、侧根及根毛数量均有抑制作用。同时，不同植物对咪唑啉酮类除草剂的耐受能力也有很大差别，耐受植物吸收此类除草剂后能依靠自身防御机制将其迅速代谢降解使其失活；非耐受植物吸收此类除草剂后反而会通过代谢产生有毒物质，对植物的生长产生抑制[7]。

近年，有关植物ALS对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的抗性(耐受)机制研究多集中在杂草和少数玉米品种上，对于玉米骨干自交系ALS的研究报道较少。我国玉米品种繁多，弄清骨干自交系对不同浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸这2类ALS抑制剂类除草剂的耐受差异，对于利用基因编辑技术培育抗ALS抑制剂类除草剂突变体过程中选择合适的受体材料具有重要指导意义。为此，以7个玉米骨干自交系为研究对象，探究这2类除草剂不同浓度处理下的玉米初生根长抑制率、苗期生长抑制率和ALS活性，评价不同玉米自交系对除草剂的敏感性差异，从而选择较敏感的自交系作为抗除草剂突变体培育过程中的受体材料。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米骨干自交系：C92、京724、京2416、B73、郑58、HZ178和178。

试剂：98%苯磺隆(Tribenuron-methyl)和96%甲咪唑烟酸(Imazapic)标准品(上海阿拉丁公司)；10%苯磺隆可湿性粉剂(山东胜邦绿野化学有限公司)和240 g/L甲咪唑烟酸水剂(德国巴斯夫股份有限公司)。

设备： Multiskan FC酶标仪(Thermo Scientific公司)和SPX-250智能生化培养箱(金坛市医疗仪器厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 不同质量浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸对各玉米自交系初生根长的抑制试验 参考柴建方等[8]的滤纸卷直立发芽法。将10%苯磺隆可湿性粉剂和240 g/L甲咪唑烟酸水剂用蒸馏水分别稀释为0.05、0.25、0.50、1.00、2.00 μg/L的溶液。在1 L的玻璃烧杯中加入苯磺隆和甲咪唑烟酸不同质量浓度梯度溶液各500 mL(空白对照加入等量蒸馏水)。精选大小一致的玉米种子，将规格25 cm×15 cm的2张发芽纸重叠，在距上部边缘3 cm左右位置处逐层卷入6粒玉米种子，之后用橡皮筋固定，放入装有不同质量浓度除草剂溶液的烧杯中，每个处理重复3次，于SPX-250智能生化培养箱中，温度(28±1)℃、相对湿度80%条件下暗培养72 h。培养结束后小心取出发芽材料，测量主根长，计算不同质量浓度除草剂对根长生长的抑制率，并以抑制率概率值(y)和质量浓度值(x)建立回归方程(y=a+bx)，求出抑制中质量浓度(IC50)[9]。抑制率=(对照根长-处理根长)/对照根长×100%。

1.2.2 不同质量浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸对各玉米自交系幼苗生长的抑制试验 以田间划分小区的方式，使每个小区内种植玉米苗数相同。根据2种除草剂生产推荐浓度及其溶解性差异分别设置4个质量浓度梯度，其中苯磺隆可湿性粉剂试验施用质量浓度分别为166、334、667、1 334 mg/L，甲咪唑烟酸水剂试验施用质量浓度分别为120、240、480、960 mg/L。用2 L手持压缩式喷雾器对三叶一心期玉米茎叶均匀喷雾至表面形成液滴，对照喷施等量清水。施药前后24 h内无降雨，药剂处理15 d后调查玉米苗生长受抑制情况，植株受抑制表现为叶片枯黄和新叶牛尾状扭曲不能正常抽出。幼苗生长抑制率=(死亡株数+受抑制株数)/小区总株数×100%。

1.2.3 不同浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸对各玉米自交系胚芽鞘ALS活性的影响试验 ALS的提取：参照范志金等[10]的方法。取暗培养3 d的玉米胚芽鞘0.5 g，剪碎后放入4 ℃预冷的研钵中，加入1.8 mL酶提取液(含1 mmol/L丙酮酸钠、0.5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP、10 μmol/L FAD的0.1 mol/L pH值7.0的磷酸缓冲液)和适量石英砂，冰浴条件下快速研磨匀浆，置于装有18 mg PVPP的2 mL离心管中，迅速旋涡混匀后置于冰上，于4 ℃、20 000 g离心15 min。取上清液1.5 mL转入干净的2 mL离心管中，冰置备用。

标准曲线制作：分别在1.5 mL离心管中加入100 μL的100、80、60、40、20、10、5、1 nmol/mL乙偶姻溶液(以5 μL蒸馏水为空白，用于调零)，加入0.5%肌酸50 μL和5% 1-萘酚50 μL，60 ℃金属浴显色15 min，迅速置于冰浴中冷却1 min后，12 000 r/min离心2 min，取上清于520 nm比色。以OD520为横坐标、乙偶姻浓度为纵坐标制作标准曲线。

离体条件下ALS活性测定：在96孔酶标板中用排枪先加入50 μL酶液，然后加入苯磺隆和甲咪唑烟酸溶液至终浓度分别为0.05、0.5、5、50、500 nmol/L(以磷酸钾缓冲液为对照)，再加入45 μL酶反应液(含1 mmol/L 氯化镁、0.1 mmol/L TPP、10 μmol/L FAD-Na2、40 mmol/L丙酮酸钠的20 mmol/L pH值7.5的磷酸钾缓冲液)，吸打混匀后在酶标仪上35 ℃温育1 h。然后加入3 mol/L硫酸10 μL终止反应，吸打混匀后在酶标仪上60 ℃脱羧15 min。最后，加入0.5%肌酸50 μL和5% 1-萘酚50 μL，吸打混匀后在酶标仪上60 ℃温育显色15 min，迅速置于冰浴中冷却1 min后，2 700 g离心2 min，取上清200 μL转入新酶标板中于520 nm比色(样品溶液A)。每份酶液设置1个灭活样(空白样品A0，50 μL酶液中先加入3 mol/L硫酸10 μL，再加45 μL酶反应液和5 μL磷酸钾缓冲液，不进行35 ℃温育，后续同步脱羧和显色)。用样品实测吸光值(A-A0)代入乙偶姻标准曲线进行线性回归分析，计算出样品鲜质量的酶活性(U/mg，以每小时生成1 nmol乙酰乳酸为1个活性单位，以乙酰乳酸脱羧生成的乙偶姻进行显色反应)。

1.3 数据统计与处理

试验原始数据均录入Excel软件后进行统计和计算分析。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸对各玉米自交系初生根长抑制率的影响

不同质量浓度的苯磺隆和甲咪唑烟酸对7种玉米骨干自交系的初生根长均有抑制作用，抑制效果均随着除草剂质量浓度的增加明显增强(图1和图2)。在苯磺隆最高质量浓度2.00 μg/L下，自交系C92的根长抑制率最高(66.4%)，自交系178的根长抑制率最低(19.5%)；在甲咪唑烟酸最高质量浓度2.00 μg/L下，自交系C92的根长抑制率最高(80.6%)，自交系178的根长抑制率最低(32.4%)。由此可知，在相同质量浓度下，甲咪唑烟酸对各玉米自交系的抑制效果强于苯磺隆。

苯磺隆质量浓度/(μg/L)Tribenuron-methyl mass concentration图1 不同质量浓度苯磺隆对各玉米自交系初生根长抑制率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of tribenuron-methyl on the inhibition rate of primary root length of mazie inbred lines

甲咪唑烟酸质量浓度/(μg/L)Imazapic mass concentration图2 不同质量浓度甲咪唑烟酸对各玉米自交系初生根长抑制率的影响Fig.2 Effects of different concentrations of imazapic on the inhibition rate of primary root length of mazie inbred lines

不同玉米自交系初生根长对苯磺隆和甲咪唑烟酸的敏感性差异如表1和表2所示，在苯磺隆抑制下各自交系的IC50值为4.70～14.19 μg/L，甲咪唑烟酸抑制下各自交系的IC50值为3.70～9.57 μg/L，C92最为敏感，178耐受能力最强。根据IC50值，各自交系对2种除草剂的敏感性均为：C92>京724>京2416>B73>郑58>HZ178>178。

表1 各玉米自交系初生根长对苯磺隆的敏感性Tab.1 Sensitivity of the primary root length of maize inbred lines to tribenuron-methyl

表2 各玉米自交系初生根长对甲咪唑烟酸的敏感性Tab.2 Sensitivity of the primary root length of maize inbred lines to imazapic

2.2 不同质量浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸对各玉米自交系幼苗生长抑制率的影响

如图3所示，各自交系幼苗的生长抑制率随着苯磺隆质量浓度的提高而升高，但是各质量浓度梯度的苯磺隆对自交系178和HZ178的抑制率明显低于其他5个自交系。当苯磺隆质量浓度为334 mg/L时，自交系C92、京724、京2416、B73和郑58表现较为敏感，抑制率达到60.7%以上；178和HZ178的抑制率在11.2%～21.1%，敏感性较低。当苯磺隆质量浓度达到667 mg/L时，178和HZ178的抑制率在21.2%～32.3%，其他5个自交系的抑制率均超过83.3%。当苯磺隆质量浓度提高到1 334 mg/L时，178和HZ178的抑制率在30.8%～45.0%，而其他5种自交系的抑制率均达到100%。由此可见，自交系C92、京724、京2416、B73和郑58相比178和HZ178对除草剂苯磺隆较敏感。

苯磺隆质量浓度/(mg/L)Tribenuron-methyl mass concentration图3 不同质量浓度苯磺隆对各玉米自交系幼苗生长抑制率的影响Fig.3 Effects of different concentrations of tribenuron-methyl on growth inhibition rate of seedlings of maize inbred lines

如图4所示，随着甲咪唑烟酸质量浓度的升高，各自交系幼苗的生长抑制率逐渐增大。在甲咪唑烟酸质量浓度为120 mg/L下，C92、京724、京2416、B73和郑58的抑制率均在50.5%以上；而178和HZ178的抑制率在30.5%～40.0%，敏感性略低。当甲咪唑烟酸质量浓度达到240 mg/L时，178和HZ178的抑制率在50.5%～61.9%，其他5个自交系的抑制率均大于80.5%。当甲咪唑烟酸质量浓度为480 mg/L时，178和HZ178的抑制率约为80%，而其他5种自交系的抑制率均达到100%。在甲咪唑烟酸质量浓度提高至960 mg/L时，7种自交系全部死亡，抑制率均达到100%。

甲咪唑烟酸质量浓度/(mg/L)Imazapic mass concentration图4 不同质量浓度甲咪唑烟酸对各玉米自交系幼苗生长抑制率的影响Fig.4 Effects of different concentrations of imazapic ongrowth inhibition rate of seedlings of maize inbred lines

综合2种除草剂在相同质量浓度下各自交系幼苗生长的抑制率，可以推断出不同自交系对2种除草剂的敏感性均为：C92>京724>京2416>B73>郑58>HZ178>178。

2.3 不同浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸对各玉米自交系胚芽鞘ALS活性的影响

随着苯磺隆浓度升高，自交系C92、京724、京2416、B73和郑58的ALS活性均呈现下降趋势；178和HZ178在苯磺隆浓度达到0.05 nmol/L之后，ALS活性相对稳定，其ALS活性受苯磺隆影响不明显(图5)。由此可见，自交系C92、京724、京2416、B73和郑58的ALS活性相比178和HZ178对苯磺隆更敏感。

苯磺隆浓度/(nmol/L)Tribenuron-methyl concentration图5 不同浓度苯磺隆对各玉米自交系ALS活性的影响Fig.5 Effects of different concentrations of tribenuron-methyl on the ALS activity of maize inbred lines

如图6所示，在甲咪唑烟酸浓度为0.05 nmol/L时，各玉米自交系胚芽鞘的ALS活性都表现出下降的趋势；随后在甲咪唑烟酸浓度升高至5 nmol/L期间，各自交系酶活性曲线波动幅度较小；当甲咪唑烟酸浓度从5 nmol/L升高至500 nmol/L期间，自交系C92、京724、京2416、B73和郑58的ALS活性曲线显著下降，而178和HZ178两者酶活性曲线无明显下降趋势。由此推断，在甲咪唑烟酸作为抑制剂的条件下，自交系C92、京724、京2416、B73和郑58的ALS活性相比178和HZ178更敏感。

甲咪唑烟酸浓度/(nmol/L)Imazapic concentration图6 不同浓度甲咪唑烟酸对各玉米自交系ALS活性的影响Fig.6 Effects of different concentrations of imazapic on the ALS activity of maize inbred lines

综合图5和图6，2种除草剂在浓度达到500 nmol/L时，甲咪唑烟酸比苯磺隆对玉米胚芽鞘内的ALS活性抑制作用更强，由此推断，7种玉米骨干自交系对甲咪唑烟酸比苯磺隆敏感。

3 结论与讨论

ALS抑制剂类除草剂在玉米田中主要用于防除禾本科杂草和某些阔叶杂草。目前已经开发的ALS抑制剂类除草剂约有13类50种之多，包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、嘧啶水杨酸类(Pyrimidinylthiobenzoates,PTB)、三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)等[11]。磺酰脲类除草剂在玉米生产中应用最多的主要是烟嘧磺隆和砜嘧磺隆，而苯磺隆的应用多集中在小麦上[12]。咪唑啉酮类除草剂的应用主要在大豆和花生上[12]，在玉米上的应用未见报道。本研究应用2种ALS抑制剂类除草剂苯磺隆和甲咪唑烟酸探讨7种玉米骨干自交系的敏感性差异。初生根长抑制试验结果表明，在苯磺隆和甲咪唑烟酸抑制下各自交系的IC50值分别在4.70～14.19 μg/L和3.70～9.57 μg/L，其中C92最为敏感，178耐受能力最强；幼苗生长抑制试验结果显示，各自交系幼苗的生长抑制率随着苯磺隆和甲咪唑烟酸质量浓度的提高而升高，但苯磺隆对自交系178和HZ178的抑制率明显低于其他5个自交系；ALS活性试验反映出自交系C92、京724、京2416、B73和郑58的ALS活性相比178和HZ178,对抑制剂苯磺隆和甲咪唑烟酸更敏感。以上试验结果表明,7个自交系对2种除草剂的敏感性均为C92>京724>京2416>B73>郑58>HZ178>178，各自交系均对甲咪唑烟酸更敏感；自交系C92、京724和京2416相比B73、郑58、178和HZ178均对苯磺隆及甲咪唑烟酸更加敏感，是利用基因编辑技术筛选培育抗ALS抑制剂类除草剂突变体的优良受体材料。

自20世纪70年代以来，国内开发出一系列超高效磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂，针对这类除草剂在实际应用中对一些敏感作物产生药害等问题，国内外专家学者进行了大量研究。陈锡岭等[13]发现，苄嘧磺隆对玉米不同品种根的生长有不同的抑制作用。谢娜等[14]发现，不同玉米品种对氯吡嘧磺隆的耐药性有较大差异，其中甜玉米耐药性最差。已有研究表明，玉米不同类型品种对烟嘧磺隆耐药性的差异是作物的遗传特性和所处的环境条件等因素共同作用的结果，其中作物的遗传特性是其产生耐药性的主要因素[15]。本研究通过对试验结果的平行比较和趋势分析发现，自交系对苯磺隆和甲咪唑烟酸的敏感性均依次为C92>京724>京2416>B73>郑58>HZ178>178，同时这些材料对甲咪唑烟酸比苯磺隆更为敏感。对于C92等对ALS抑制剂类除草剂较敏感的材料，应在生产中选择合适剂量以避免发生药害。

王焕民[16]通过研究表明，由于磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的水溶性不同，外界条件中土壤pH值对于两者的活性和安全性影响较大。KOEPPE等[17]指出，不同植物对磺酰脲类除草剂的耐药性差异主要与其代谢降解速度有关。另有YOON等[18]指出，Lys255F和Lys255Q突变可以导致植物对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂产生很强的抗性。对ALS抑制剂类除草剂的抗性机制可概括为：(1)除草剂在作物体内的代谢功能提升；(2)作用靶标发生变异使除草剂毒力降低；(3)作物不同的吸收和传导作用使到达作用部位的药量下降[19]。本研究在生理和形态指标上初步探索了玉米不同骨干自交系对不同浓度苯磺隆和甲咪唑烟酸的耐药性差异，对于各自交系间产生这些差异的原因，有待于从代谢降解途径和ALS作用靶标等生化机制方面开展进一步的研究。