纳米生物技术在淋巴瘤中的应用研究进展

刘 娜，张晓林，彭嘉宜，刘 芳

（佛山科学技术学院医药工程学院，广东佛山528000）

纳米生物技术是利用现代多种学科技术加工成纳米粒径物质用来研究生命现象的技术。纳米材料粒径大多在1～100 nm范围，当物质到达纳米尺寸后，其性能发生突变，出现特殊性能，如小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应等。其生物学特性便于它们高效携带各类小分子物质，如核酸、蛋白质、小分子药物等，且纳米材料的大小、形状及表面特性可以依照需要来设计与调整。随着对新型纳米材料的深入研究以及纳米颗粒在肿瘤检测、诊断、治疗方面的持续研究应用，纳米医学经历了前所未有的发展，甚至产生了新学科，即纳米肿瘤学［1-2］。本文探讨纳米生物技术在淋巴瘤方面的研究情况。

1 淋巴瘤的现状

恶性淋巴瘤（malignant lymphoma，ML）是源于淋巴造血系统的一大类肿瘤，大体可分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkin Lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin Lymphoma,NHL）。在国内，非霍奇金淋巴瘤所占比例远高于霍奇金淋巴瘤，其中B细胞淋巴瘤最常见，占据85%，且发病率呈增高趋势。

淋巴瘤的诊断同其他肿瘤一样，一般是首先由临床医生依据临床表现以及血液、骨髓、超声等实验室检查疑是该病，然后通过病变组织的病理检验而确诊。但是淋巴瘤的早期临床表现并不典型，寻求早期诊断方法或标志物成为研究热点。

目前恶性淋巴瘤的临床治疗主要包括手术、联合化疗、造血干细胞移植等。大多数非霍奇金淋巴瘤的一线治疗方案是R-CHOP方案为主的综合治疗，即利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松化疗，完全缓解率较高，但易产生较严重毒副作用，且淋巴瘤的异质性高，仍有相当多患者复发/耐药［3-4］。因此复发/难治性使得常见的B细胞淋巴瘤成为当前基础与治疗研究的焦点和热点。

淋巴瘤细胞表面表达标志性分子，为治疗提供了理想靶点，如CD20、CD22、CD30等。CD20是一类表达于所有成熟B细胞以及成熟B细胞淋巴瘤细胞，目前利妥昔单抗是第Ⅰ代抗CD20单抗，第Ⅱ代CD20单抗处在临时试用阶段。CD22只选择性表达于正常和恶性的成熟B淋巴细胞，60%～80%的B细胞淋巴瘤表达CD22。

2 纳米生物材料的类型

随着研究的深入，纳米生物材料的种类越来越多，分类方法复杂，大体可分为两大类。1）以有机分子作为主要材料，如脂质体、树枝状大分子等。脂质体在许多肿瘤研究中被用作药物递送载体［5-6］。在核磁共振成像中用作造影剂的树枝状分子已经起到了重要辅助作用,负载药物或靶标分子的树枝状分子又有望成为药物递送载体和肿瘤的选择性成像［7-8］。2）以无机材料作为纳米颗粒的中心，如磁性颗粒、金属、二氧化硅等，中心外面依据需要修饰多种有机物质，如多肽、蛋白质、核苷酸等。

另外，量子点是一种由Ⅱ-Ⅵ族元素（如 CdTe，CdSe，ZnS等）或Ⅲ-Ⅴ族元素（如 InP，InAs等）组成的粒径在1～10 nm之间的荧光半导体纳米材料，与有机荧光染料相比，其光谱特征优良和光化学稳定，从而引起生物医药领域的广泛关注［9-10］。

3 纳米技术与淋巴瘤

3.1 纳米技术与淋巴瘤的成像检测

肿瘤的早期精确诊断是提高治愈率的关键。影像学尤其是分子影像学的快速发展在疾病的早期诊断、药物筛选、实时评价治疗效果以及诊疗一体化等方面发挥着越来越重要的作用。分子影像学的核心之一是高特异性、高亲和力、安全的影像探针。相对于传统的分子形探针，纳米探针具有影像信号强度大、靶向效果好、代谢动力学可控等显著的优点，近年来得到了飞速发展［11］。

Zhong H等［12］制备了一种DNA-量子点笼型细胞探针，可用于快速定性、精确定量分析B淋巴瘤细胞，与通常的细胞标记法相比，该探针显示更高的荧光强度，且此种功能材料可长时间保存不变质。马旭妍等［13］利用免疫性磁性纳米球实现了对淋巴结转移癌病人淋巴结穿刺物中淋巴结转移癌细胞的快速高效准确检测，具有潜在的临床应用价值。韩青林等［14］将碘化物近红外荧光染料复合到介孔硅纳米颗粒中得到一种增强型近红外介孔硅纳米颗粒，肿瘤中持续至少10 d还可检测到荧光信号，在体内外淋巴瘤成像中具有良好的溶解性和代谢稳定性。体外实验时该纳米颗粒还可通过滞留效应被动靶向肿瘤。Christina等［15］利用PEG-藕联表面增强拉曼散射染料标记金纳米颗粒，可以同时检测到3种恶性B细胞的特异表面蛋白，有助于提高流式细胞仪检测白血病和淋巴瘤等血液肿瘤的特异性和敏感性。Soubhagya等［16］利用磁性纳米颗粒藕联抗CD20抗体实现特异性循环肿瘤细胞的检测与有效分离。

3.2 纳米材料作为抗淋巴瘤药物的载体

纳米载体能很好地携带、稳定释放淋巴瘤常用化疗药物。目前许多材料被用来构建递送抗淋巴瘤药物的纳米颗粒，如石墨烯、金属纳米颗粒、介孔二氧化硅、脂质体、DNA等。

Ander等［17］利用负载依地福新的脂质纳米颗粒可明显减轻药物的溶血毒性，延长药物血浆浓度，在动物实验中提高药物在淋巴结富集浓度，减慢肿瘤的生长速度。Du L等［18］将阿霉素负载于石墨烯-聚乙二醇获得纳米复合物，其阿霉素的载药率接近于100%，水溶性与稳定性较好，体外细胞实验提示该复合物未降低阿霉素对淋巴瘤细胞的毒性。单永锋等［19］利用聚左旋乳酸和聚乙烯醇作为膜壳材料，制备包裹阿霉素和油酸修饰的氧化铁纳米颗粒，它可提高体外磁共振及超声显像效果，其联合超声可增强阿霉素对DLBCL细胞株SU-DHL4的细胞毒作用，从而诱导细胞调亡，对ML诊疗一体化具有潜在应用价值。

唐亚芳［20］等制备了靶向淋巴瘤细胞的DNA折纸载体，载体载药后提高了阿霉素的稳定性并延缓其释放，与游离阿霉素相比，折纸载药系统明显提高了K299细胞的凋亡率，且能抑制细胞增殖。

3.3 纳米材料提高抗淋巴瘤药物的靶向性

为使载药纳米颗粒能更有效地靶向肿瘤组织，并减轻毒副作用，研究人员尝试用特异性的靶向治疗分子负载于纳米颗粒。

3.3.1 CD20分子靶向

CD20分子是治疗B细胞淋巴瘤理想的靶抗原。抗CD20抗体在体内的半衰期短，效果温和，但是多次用药后易耐药。此外，由于免疫检查点的存在，肿瘤细胞容易发生免疫逃逸。因此，从抗体作用机制和肿瘤微环境出发，构建多功能抗体提高疗效是临床抗体靶向治疗亟待解决的问题。近年来，基于纳米技术、材料的特点与发展，纳米载体技术的递送系统为解决上述问题提供了完美的解决方案。

Nevala W K等［21］利用白蛋白、紫杉醇和利妥昔单抗制成CD20抗体靶向纳米递送系统，提高了B细胞淋巴瘤的靶向性和化疗药物的疗效。Song L等［22］利用PEG修饰磁性Fe304纳米颗粒，修饰后的纳米颗粒水溶液稳定性、生物相容性良好。又偶联多个利妥昔单抗美罗华，形成多价纳米探针，多价探针明显促进CD20阳性淋巴瘤细胞的凋亡，且促凋亡作用随抗体数的增加而增加。小鼠体内实验显示，小鼠生存期明显延长。肿瘤生长速度较为缓慢，小鼠体重可维持在一定范围内。多价纳米探针在72 h时仍然累积于肿瘤区域，说明此探针具有良好的体内靶向效果，为临床淋巴瘤分子成像提供了实验依据。

Zhou S等［23］利用Amine-PEG2000-Biotin修饰介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）为载体基础，联接抗CD20的利妥昔单抗，并负载细胞毒性药物多柔比星制成纳米复合体，其生物相容性好，毒副作用小，其载药率和包封率分别是约25%、45%，具有pH值响应性的控释药物性能，在酸性环境中促进药物释放，对于CD20+B细胞淋巴瘤具有特异性的靶向性功能、增强的抗肿瘤活性以及较强的凋亡诱导能力。Li H等［24］应用纳米技术将两种不同类型的CD20抗体（I型和II型）用聚乙烯亚胺载体交联，构建一种抗CD20纳米抗体梳，同游离的抗体药物相化，该纳米抗体梳能显著延长荷瘤小鼠的总体生存率和中位生存时间，降低荷瘤小鼠的肿瘤负荷。更为重要的是，该纳米抗体梳对利妥昔单抗耐药的非霍奇金淋巴瘤细胞仍然具有很好的杀伤效果。

3.3.2 CD20和PD-L1分子双靶向

程序性死亡受体-1（programmeddeath 1，PD-1）是T细胞表面表达的共刺激分子，抑制T细胞在免疫应答反应中的激活，可能为肿瘤细胞提供免疫逃逸导致肿瘤发生［25］。以PD-1为靶点的免疫调节可唤起机体对肿瘤细胞的免疫反应，对抗肿瘤治疗具有重要的意义。

Wand J等［26］利用高分子聚乙烯亚胺构建CD20和PD-L1分子双靶向纳米抗体团簇，发现纳米抗体团簇可以更长时间的结合在靶细胞表面，持续作用时间更持久，对Daudi细胞除了具有增殖抑制和细胞毒性作用外，还具有抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用和程序性细胞死亡作用。体内实验研究表明，抗体团簇组比单抗组具有更强的抗肿瘤效果，减轻肿瘤负荷效果好。其机制可能是抗体团簇通过抗CD20抗体特异性靶向肿瘤细胞，抗PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1信号通路，恢复CTL细胞的抗肿瘤活性，两种抗体协同发挥抗肿瘤作用。

3.3.3 CD22分子靶向

CD22是免疫球蛋白超家族中的成员，限制性地表达于成熟B细胞和大多数B淋巴瘤细胞表面，以CD22为靶点，进行肿瘤免疫治疗已经成为免疫研究热点之一。

张美娇等［27］利用PEG聚合物、唾液酸等修饰量子点，负载CD22得到了功能性纳米荧光材料，其粒径分布均匀，荧光性能良好，低生物毒性，对细胞表面跨膜糖蛋白 CD22具有较强的靶向性，但未做体内动物实验。Chen W C等［28］利用负载阿霉素的靶向CD22的脂质体纳米颗粒,实验结果表明，该纳米颗粒具有作为治疗B细胞恶性肿瘤的替代方法的潜力。

3.4 纳米抗体/药物与淋巴瘤

纳米抗体是由骆驼科动物缺失轻链的天然重链抗体的可变区组成的单域基因工程抗体，相对分子量仅为15×103。与传统抗体相比，其具有稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低、穿透力强等特点［29］。

孙赟等课题组［24，30］利用纳米技术将I和Ⅱ型两种抗CD20抗体偶联制备纳米抗体团簇。结果发现，与游离抗体相比，抗体团簇诱导凋亡能力大大增强，后期又同时将I型抗CD20抗体与具温敏功能的高分子长链（PI-4-R）连接而构建成纳米抗体。相比游离单克隆抗体，它能够赋予母代抗体不具备凋亡诱导功能，并通过补体依赖的细胞毒性作用和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用等发挥作用，且该作用能够被纳米粒子所特有的EPR效应进一步协同增强，从而具有更强大的体内外抗肿瘤作用。

雄黄在肿瘤治疗中的应用日益为人们所关注,但是临床中用到的雄黄复方制剂是粒径在微米级的雄黄，存在临床用药量大、生物利用度低等缺点。采用纳米技术解决难溶性雄黄的生物利用度、降低毒副作用等问题是目前雄黄研究热点之一。姜爽等［31］研究发现，相比水飞雄黄，相同剂量的纳米雄黄在相同作用时间下，可明显抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞的增殖，破坏其亚细胞结构，进而引起其凋亡。

3.5 纳米技术与淋巴瘤的热疗

肿瘤热疗是利用物理能量加热人体全身或局部，利用正常组织和肿瘤细胞对热敏感性的差异，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度，并维持一定时间，达到既能使肿瘤细胞凋亡、又不损伤正常组织的治疗目的。热疗法主要包括磁热疗、热疗法等，对于手术与放、化疗等治疗手段有明显的增效和补充作用。纳米材料尤其是纳米金属材料具有良好的热学性能和能量吸收聚集作用，以它作为介质，同时负载抗肿瘤药物，在外界物理刺激的作用下，可以显著提高热疗法对淋巴瘤的效果以及靶向性。

X Qu等［32］研究发现光热治疗霍奇金淋巴瘤细胞时，引起结合负载CD30抗体纳米金颗粒的癌细胞广泛损伤，对照组细胞只有轻微少量的损伤。Kouji Tanaka等［33］利用磁铁阳离子脂质体作为人工高热的加热介质，与单独高温治疗相比，显著提高了热疗效率。

铂纳米颗粒对热疗的作用就不同。铂纳米颗粒具有抗肿瘤活性，且抗氧化性能好。Yoko等［34］利用铂纳米颗粒预处理人类骨髓单核细胞淋巴瘤细胞和人类皮肤T细胞淋巴瘤细胞，后再热疗。发现纳米铂颗粒以剂量依赖性方式显著抑制热疗诱导的细胞凋亡。表明纳米铂和热疗的组合可导致热疗脱敏。

3.6 纳米技术与淋巴瘤的基因治疗

基因治疗历经30多年的研究，新的编辑技术出现极大推动了基因治疗的发展，基因治疗取得成功，还需要理想的基因载体，目前所用的载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率较高，但副作用较大，并且有可能引起基因损伤，限制了其治疗中的应用。纳米载体作为非病毒载体，具有独特的物理和化学性质，在介导基因转染方面有一些潜在的优势［35］，如生物相容性良好、粒径小、相对容易制备，结构可控，易于修饰，可实现基因的靶向递送、具有较高的电势和比表面积，所以基因载量较大，并能有效防止基因被机体内的核酸酶降解等。

Christopher等［35］利用脂质纳米颗粒将靶向Mcl-1的siRNA递送到套细胞淋巴瘤细胞中，可诱导肿瘤细胞凋亡。Martucci等［37］的研究表明藕联特异免疫型肽的硅基纳米颗粒生物相容性好、靶向性的B细胞淋巴瘤细胞摄入率高，成功负载bcl-2-siRNA并表达。Uckun等［38］设计多肽纳米颗粒递送靶向CD22ΔE12的siRNA，证明他们的CD22ΔE12siRNA-纳米颗粒可以敲低CD22ΔE12并抑制B细胞淋巴瘤细胞生长。耶鲁大学Imran等［39］研究人员构建一种包封抗miRNA-155的聚乳酸乙醇酸纳米颗粒，在体内它能安全、有效地沉默基因，体外能有效递送重组RNA，并能抑制miR-155的表达和减慢前体B细胞肿瘤的体内生长。

虽然纳米材料作为基因治疗的载体仍处于研究发展的早期阶段，但目前的研究结果已提示基于纳米颗粒的靶向基因递送系统的优势，表明对于淋巴瘤临床使用的治疗有巨大潜力，为进一步提高基因治疗的靶向性和疗效提供了可能。

4 小结

目前发现纳米技术在淋巴瘤的应用研究中，具有提高淋巴瘤细胞快速精确检测、具有缓释药物、精确靶向、增强药物疗效以及减低毒副作用等作用。虽然纳米技术在淋巴瘤应用研究大部分仍限于体外细胞和动物实验，距离临床应用中还有一段路要走。但是，纳米生物技术在肿瘤领域中所展现的优越性预示着它在淋巴瘤等肿瘤中的应用前景很广阔。