β1-AR/CMC-UPLC/MS联用的分析方法筛选辛夷中的活性成分

程永杰,张府君,王 新,李晓妮*

(1山西药科职业学院中药系中药教研室,太原 030031;2山西医科大学药学院药物分析教研室;*通讯作者,E-mail:87134858@qq.com)

细胞膜色谱法(CMC)在药学筛选活性成分研究中作用很广泛,该法是将含药物受体的细胞膜固定在硅胶载体表面,制备成细胞膜固定相(CMSP),利用液相色谱法研究流动相中药物与固定相上细胞膜相互作用的受体动力学新方法[1]。此法中药物不需要经过提取和分离而可以直接在细胞膜色谱法模型上完成活性成分的筛选。

辛夷又称望春玉兰花(MagnoliabiondiiPamp.),临床上主要用来治疗急慢性鼻炎、过敏性鼻炎和其他的鼻炎[2],除此之外还有收敛作用、保护黏膜、改善局部血液循环、促进分泌物的吸收以及抑菌、抗炎、降压等其他药理作用。β1肾上腺素受体(β1-AR)是心脏组织中肾上腺素受体的主要亚型,其基因表达变化与心衰、高血压等心血管疾病的发生、发展及治疗密切相关[3]。鉴于此,本课题通过获得细胞膜高表达β1-AR的细胞株,在此基础上制备膜色谱柱,建立起β1-AR高表达的CMC系统[4],再利用β1-AR/CMC分析方法对辛夷的作用靶点进行研究,筛选辛夷中潜在活性成分,为辛夷的药效物质基础和治疗高血压新药研发提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

大孔球形硅胶(青岛美高集团有限公司);中国仓鼠卵巢S亚型(CHO-S)细胞、高表达的β1-AR/CHO-S细胞由山西医科大学药物分析实验室提供;美托洛尔(Meto)、异丙肾上腺素(ISO)、地西泮(DZ)、辛夷脂素(Far)对照品(均购自中国药品生物制品检定所);辛夷药材(购自国药集团山西分公司);色谱级甲醇(Fisher Scientific公司);纯净水(自制);石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(天津四友化学试剂公司);其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

LC-10AT高效液相色谱仪,LC solution色谱工作站,日本岛津;Waters ACQUITY UPLC三重四级杆串联质谱仪(Waters Corp.,Manchester,UK);TU-1901双光束紫外可见光分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;ZZXT-A型装柱机,大连日普利科技仪器有限公司;TGL-16M台式高速冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;pHS-25型pH计,上海雷磁仪器厂;KQ-3200DE型超声波清洗机,昆山市超声仪器有限公司;电子天平,北京赛多利斯天平有限公司。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取Meto、DZ、Far对照品5.00 mg,置于5 ml容量瓶中,加甲醇使溶解,甲醇加至刻度摇匀,即得浓度为1 mg/ml的对照品储备液。

2.1.2 辛夷供试品溶液的制备 取辛夷药材100 g,粉碎,过40目筛,取约50 g,置圆底烧瓶中,加95%的乙醇400 ml浸泡,60 min后,连续回流提取3次,每次90 min,合并提取液,真空抽滤后蒸干,即得辛夷提取物。取辛夷提取物100 mg,置100 ml容量瓶中,加甲醇使溶解,甲醇加至刻度摇匀,即得浓度为1 mg/ml的供试品溶液,避光放置在4 ℃条件下保存。

2.1.3 β1-AR/CMC色谱柱及CHO-S/CMC色谱柱的制备 在4 ℃下,将生长状态良好的高表达β1-AR/CHO-S细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,在1 000 r/min条件下,离心10 min,过滤,将沉淀与低渗液10 ml混合,超声20 min,再在12 000×g条件下离心10 min,过滤,取沉淀与生理盐水5 ml混匀,得到高表达的β1-AR/CHO-S细胞膜悬液[5]。依据参考文献[6]将高表达的β1-AR/CHO-S细胞膜悬液与活化硅胶混合制备β1-AR/CMC色谱柱。将制备好的β1AR/CMC色谱柱连接至色谱系统使用。

2.1.4 β1-AR/CMC分析 色谱柱:高表达β1-AR/CMC色谱柱(10 mm×2 mm,5 μm);检测波长:美托洛尔为275 nm,地西泮为254 nm,辛夷提取物、辛夷脂素283 nm;流动相:5 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH 7.4);流速:0.2 ml/min;柱温:37 ℃;进样量20 μl;将细胞膜色谱柱与液相色谱连接,用5 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH 7.4)平衡60 min后再进行进样分析,整个分析过程均保持在细胞膜色谱柱的活性期内进行。

用96孔板分别收集β1-AR细胞膜色谱柱的流出组分,合并,用真空旋转蒸发仪浓缩、干燥,用于UPLC/MS分析。

2.1.5 UPLC/MS分析 色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);以乙腈为流动相A,以0.2%乙酸溶液为流动相B,梯度洗脱;流速0.2 ml/min;柱温40 ℃;进样量5 μl。

质谱条件:喷雾电压3.5 kV,离子源为ESI+;除溶剂气体为N2,除溶剂温度为350 ℃;离子源温度120 ℃。

2.2 实验结果

2.2.1 β1-AR/CMC方法可行性分析 取Meto与DZ的混合对照品溶液注入β1-AR/CMC色谱系统,结果见图1。R0和R1分别为β1-AR/CMC色谱系统的未保留组分与保留组分(图1A),收集各流出组分,浓缩、蒸干,按2.1.2方法制备后注入UPLC/MS系统进行鉴定,质谱数据(见图1B、1C)表明,R0-1为阴性药物地西泮,R1-1为阳性药物美托洛尔。

2.2.2 对辛夷提取物的筛选结果 图2结果显示辛夷提取物在β1-AR/CMC柱上有明显的保留峰(见图2A),而在纯硅胶色谱柱上无保留(见图2B),收集R1的流出液,浓缩、蒸发、用适量甲醇制备后注入UPLC/MS进行分析,结果见图2C。从UV和MS(见图2D)及文献所报道的数据[7,8]分析,可知R1中的活性成分为辛夷脂素Far。

图1 混合对照品的β1-AR/CMC-offline-UPLC/MS色谱图Figure 1 Chromatograms of mixed standard solution with β1-AR/CMC-offline-UPLC/MS method

图2 采用β1-AR/CMC-Offline-UPLC/MS法分析辛夷脂素提取液获得的色谱图Figure 2 Chromatograms of Far extract with β1-AR/CMC-offline-UPLC/MS method

3 讨论

现代药理研究表明,辛夷的水或醇提取物具有一定降压作用,其降压机制与扩张血管、阻断神经节及抑制心脏有关[9,10]。本课题利用建立的β1-AR/CMC-offline-UPLC方法筛选出辛夷脂素是辛夷中与心肌细胞膜有结合的活性成分,且通过β1-AR/CMC的分析,确定了辛夷脂素能与β1-AR相互作用。通过细胞膜色谱法筛选,研究者可以获得活性化合物。同时,受体动力学认为药物一般是通过药物与受体或者药物与相应的分子通道相互作用发挥药理作用[11]。利用细胞膜色谱模型筛选的活性化合物一般在药理试验验证中具有较强的生物活性[12]。实验结果表明,辛夷脂素在β1-AR/CMC模型上具有和阳性药物美托洛尔相似的保留特点,提示其可以作用β1-AR,可能是β1-AR拮抗剂。

细胞膜色谱模型是一种体外研究方法,一定程度上能体现药物与受体作用的情况,而药物发挥其药效作用是个复杂的过程,因此有必要进行药理实验,以进一步评价、验证筛选出的活性化合物的药理作用。