针刺对VD模型大鼠脑组织细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、NFK-βp65及PTEN mRNA表达水平的影响*

陈英华，王浩宇

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

血管性痴呆是指由于缺血性或出血性脑血管病，或者心脏和循环障碍引起的血流灌注所致的认知功能障碍[1-3]。临床表现有记忆力下降、认知功能下降、定向力丧失、行为异常、日常社交及生活能力低下等, 是临床常见的多发病。近年来，此病发病率呈上升趋势, 大大提高了脑血管病患者的患病风险及愈后康复治疗，降低了患者的生存质量, 给患者及家人带来了痛苦和负担。关于血管性痴呆的中医药治疗取得了一定的成就。经大量科学研究和临床观察证实，传统针刺能够明显改善痴呆患者的记忆能力和提高患者的生活质量[4]。本次实验采用四血管阻断法制作VD大鼠模型后，选取左右神聪穴、风池穴进行针刺，观察VD大鼠的记忆能力，检测大鼠脑组织中引起细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、NFK-βp65及PTEN mRNA表达的变化，论证针刺对于防治VD的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 选用168只健康SD大鼠，动物于安静环境下分笼饲养7天。将大鼠进行Morris水迷宫初筛，以测试大鼠对水迷宫学习与记忆的获取能力。连续5天后，于第6天对大鼠的行为学进行检测，筛选出符合实验条件的大鼠模型。结果显示，实验对象全部合格。

1.1.2 仪器 2135型组织切片机(德国莱卡)；Moticam3000显微摄影成像系统(美国Motic)；Motic Med6.0病理图像分析系统(美国Motic); 电热恒温箱(上海一恒)；医用微波炉(日本松下)。

1.1.3 试剂 兔抗caspase-3多克隆抗体(武汉博士德)；兔抗NFK-βp65多克隆抗体(武汉博士德)。

1.2 方法

1.2.1 VD模型建立 模型采用国际公认的Pulsinelli四血管阻断法制作[5]。大鼠术前禁水、食。麻醉大鼠，固定，取颈部正中切口, 分离双侧椎动脉，用电凝针烧灼使之形成永久性闭塞，注射适量青霉素于手术部位以抗感染。24 h后取腹部正中切口, 分离双侧颈总动脉, 用4号丝线穿线，牵拉颈总动脉但不影响颈动脉血流，使用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min共3次，1 h 1次。术后注射适量青霉素于施术部位，缝合，饲养观察，连续7天给每只大鼠肌肉注射青霉素80 000 U以对抗感染。

1.2.2 实验方法 在样本中随机筛选出两组大鼠各24只分为正常组、假手术组，将剩余备用的120只大鼠制作VD模型。将造模成功的72只大鼠随机分为3组(模型组、手针组、电针组)，各24只，在造模后的第7天、第14天及第21天对5组大鼠进行观察、测试，每次挑选8只观察。

正常组：不予任何处置。

假手术组：手术过程同VD模型制作方法，但不电凝双侧椎动脉，不阻断双侧颈总动脉。

模型组：只造模。

手针组：选取左右神聪穴、风池穴参照李忠仁主编《实验针灸学》[6]。操作方法：造模7天后，用0.30 mm×40 mm毫针针刺左右神聪穴，平刺2.5 mm,双侧风池穴，斜刺5 mm，捻转1 min，休息1 min，再捻转1 min，再休息1 min，再捻转1 min，留针，治疗每次30 min，日1次。在治疗的第7天、14天、21天分别对大鼠进行行为学测试以及各观察指标测试。

电针组：于造模成功后第7天开始针刺，选取左右神聪穴、风池穴。具体方法同手针组，然后连接长城牌KWD-808Ⅰ型脉冲电疗仪于同侧穴位，选取连续波，设定电压2 V，频率为2 Hz，电流100 μA，以大鼠肢体微颤为度。每次留针30 min，日1次。

1.2.3 大鼠行为学检测 实验采用Morris水迷宫测试大鼠的行为学习、记忆能力。水迷宫测试包括定位航行实验、空间搜索实验。通过记录大鼠寻找并爬上水下平台所需要的时间来检验大鼠的学习能力。通过记录大鼠在规定时间内穿过原平台相应位置的次数来进行空间搜索实验可检测大鼠平台空间位置的记忆能力。记录造模前、造模后14天实验数据进行分析比较。

1.2.4 大鼠海马区Caspase-3、NFK-βp65阳性蛋白数 于针刺治疗的第7天、第14天、第21天的时间点进行水迷宫测试完毕后，采集标本，用4%多聚甲醛PBS200 mL灌注固定，取脑，分离海马称重，分别标记。采用PV两步法，严格按照说明书操作。海马内的Caspase-3、NFK-βp65阳性蛋白表达呈现黄色或棕黄色颗粒。采用Motic Med6.0病理图像分析系统，每组选取8例分析并计算阳性细胞总数，取平均值。

1.2.5 大鼠海马区PTEN mRNA检测 RT-PCR测定PTEN mRNA的表达取大鼠海马区100 mg，应 用RNA提取试剂盒提取得总RNA。将RNA逆转录成cDNA，然后使用Primer Premier 5.0软件设计引物并进行扩增。以β-actin 为内参进行RT-PCR，引物的序列分别为：PTEN mRNA扩增引物：上游5′gCgAgCTgTTTTTCCACCTCT 3，下游5′TgATgTCgCggTACACCACAT 3′；β-actin扩增引物：上游5′CAACCgTgAAAAgATgACCCA 3，下游5′AATgCCAgTggTACgACCAgA 3。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果分析

2.1.1 各组大鼠逃避潜伏期比较 由表1可知，造模前各组大鼠逃避潜伏期无明显差异，比较结果无统计学意义(P>0.05)；造模后14天模型组、手针组、电针组大鼠与造模前各组对比逃避潜伏期明显延长，差异极显著(P<0.01);造模后14天，手针组、电针组与模型组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.1.2 空间探索试验比较 由表2可知，造模前，各组大鼠成功穿越平台次数无明显差异，结果不具有统计学意义(P>0.05)；造模后14天模型组、手针组、电针组大鼠成功穿越平台次数与造模前相比明显减少，差异极显著(P<0.01)。显示造模成功。与模型组比较，手针组大鼠成功穿越平台次数明显升高(P<0.05);电针组更为明显(P<0.01)。

表1 造模前、造模后14 d各组大鼠逃避潜伏期的比较

注：与造模前比较，**P<0.01;与模型组比较，▲P<0.05。

表2 造模前、造模后14 d各组大鼠穿越平台次数的比较次)

注：与造模前比较，**P<0.01;与模型组比较，▲P<0.05,△△P<0.01。

2.2 治疗前后各组大鼠海马区caspase-3、NFK-βp65阳性细胞数的变化

由表3可知，正常组和假手术组海马区caspase-3阳性细胞数较少于其他3组，模型组海马区caspase-3阳性细胞数较多。在3个不同时间点，手针组、电针组的大鼠海马区caspase-3阳性细胞数相比同一时刻的模型组阳性细胞数有所下降，说明针刺治疗(手针、电针)均能降低caspase-3的阳性表达。见封三彩图1。

由表4可知，正常组、假手术组大鼠海马区均可见少量NFK-βp65细胞。模型组NFK-βp65细胞阳性表达较多，且在3个时间点内测得的阳性细胞表达呈递增趋势。在3个时间点上，手针组、电针组大鼠的NFK-βp65阳性表达与同时刻模型组相比较有所下降，具有显著性差异，说明针刺可以降低VD大鼠海马区的NFK-βp65阳性表达。见封三彩图2。

2.3 RT-PCR检测大鼠海马区PTEN mRNA结果

由表5可知，治疗后各个时间点大鼠海马区均有PTEN mRNA表达，正常组和假手术组PTEN mRNA表达较弱；治疗后各组同一时间点，与正常组比较，模型组、手针组、电针组的PTEN mRNA表达水平明显增高(P<0.01)。治疗后各同一时间点，手针组、电针组的PTEN mRNA表达水平较模型组低，均有显著性差异(P<0.01)，且电针组较显著。见图3。

图3 各组大鼠海马组织中PTEN mRNA表达

组别n治疗第7 d治疗第14 d治疗第21 d正常组819.88±3.2719.88±3.2719.88±3.27假手术组822.00±2.2421.00±5.0922.38±3.81模型组835.13±1.73**★★40.38±4.50**★★45.00±5.90**★★手针组829.63±3.38**★★▲▲31.75±3.28**★★▲▲29.75±3.33**★★▲▲电针组831.38±2.19**★★▲33.88±2.42**★★▲▲31.13±3.31**★★▲▲

注：与正常组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与假手术组比较，★P<0.05，★★P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表4 各组大鼠海马区NFK-βp65阳性细胞数比较

注：与正常组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与假手术组比较，★P<0.05，★★P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

表5 各组大鼠海马组织中PTEN mRNA相对表达量比较

注：与正常组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与假手术组比较，★P<0.05，★★P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 讨论

Morris水迷宫实验是由Morris本人于1981年建立的，通过强迫实验动物游泳并学习寻找隐藏在水中平台的方法来测试实验对象对空间位置觉和方向觉的学习记忆能力。水迷宫实验主要包括定位航行实验、空间探索实验等。实验系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和软件分析系统组成[7]。本次实验运用Morris水迷宫对大鼠在造模前、造模后进行行为学测试，检测结果直观、明显。

VD动物模型的制作，是研究发病机制、治疗药物等的重要条件，其中较为常见的方法为血管阻断法[8-9]，其中包括两血管阻断法、三血管阻断法、四血管阻断法、双侧颈总动脉狭窄法、单侧颈总动脉闭塞法、大脑中动脉阻断法、血管栓塞法。本次实验采用四血管阻断法制作VD模型大鼠[10]，可高度模仿VD发病特点，病理改变充分，无明显肢体活动障碍，且在不断被改进完善中。

血管性痴呆属中医“呆病”“癫痴”等范畴[11]，明代张介宾《景岳全书·杂病谟》首先提出了痴呆的病名、病因病机、临床表现、预后和治法，云：“痴呆证，凡平素无痰而或以郁结，或善愁，或以不遂，或以思虑，或以疑惑，或以惊恐，而渐致痴呆，言辞颠倒，举动不惊，或多汗，或善愁，其证则千奇百怪，无所不至。”明代李时珍《本草纲目·辛夷》提出：“脑为元神之府。”清代王清任《医林改错·脑髓说》明确指出：“灵机记性，不在心在脑”。故本病病变部位在脑，与心肝脾肾功能失调密切相关。为本虚标实之病，临床上多见虚实夹杂之证，脏腑之精血清气上注于脑，脑窍蒙蔽则心神不稳，发为痴呆。故血管性痴呆的治疗重点应该在脑，而历代医家亦有“病变在脑, 首取督脉”之说。督脉行于脊里，总督人体一身之阳，其“上额交巅, 入络脑”，且督脉源于胞中, 出会阴而络于肾, 肾藏精生髓, 髓充脑,宁则神安。故脑窍清明、神志调和与督脉条畅与否密切相关[12]。中医治疗痴呆以补虚为主，同时根据痰、瘀、火、毒轻重分别兼以化痰、祛瘀、清火、解毒等。痴呆的预防首先是针对痴呆的危险人群，在无症状期采取必要措施干预痴呆的危险因素，清淡饮食、快步行走等具有延缓或预防痴呆的作用。其次是针对痴呆的前驱期人群，在患者轻度认知损害阶段，积极治疗并跟踪随访，对延缓其发展为痴呆具有重要意义。

现代研究证明，针灸对于治疗VD具有显著疗效。针灸可以明显改善VD患者的临床症状，改变其血流动力学、血液流变学，改善患者的脑部功能，改善痴呆症状，提高智力，增强社会活动能力。

四神聪穴，经外奇穴，位于头顶部，当百会穴前后、左右各1寸，共4穴。据历代文献记载，其主治有头痛、痴呆、眩晕、癫痫等症[13]。王清任认为“脑为元神之府，灵机记忆在脑不在心”“多年无记忆者，脑髓渐空”。风池穴出自《灵枢·热病》, 另名热府, 属足少阳胆经, 为手、足少阳、阳维之会。巅顶之上, 惟风可到, 风池穴位居头项, 形象如池, 是风邪易于留恋和治疗风邪当取之处, 故风池以此得名，该穴具有熄风潜阳、疏风解表、清脑安神、聪耳明目、舒筋通络之功效[14]。胆主少阳, 为开合之枢机, 可外开太阳, 内合阳明。风池位于胆经, 可调畅气机, 升清降浊, 由里及表, 只要涉及胆经经脉循行部位及脏腑气机不利, 并出现相关病变, 即可应用风池穴进行治疗[14]。从现代解剖位置而言, 头部穴位周围分布有丰富的血管和神经, 其中包括左右颞浅动脉、左右颞浅静脉及枕动、静脉吻合网等。故取四神聪穴、风池穴行针刺，以开窍醒脑、提神益智、养心安神，改善脑部血液循环，改善脑神经细胞的电生理活动，从而提高脑的功能，改善痴呆症状，提高患者的生活质量。

实验将传统中医学理论及现代医学理论有机结合，根据导师多年的临床经验指导下完成，通过针刺四神聪穴、风池穴治疗VD。通过实验发现,造模成功后VD大鼠表现出明显的学习记忆障碍，Caspase-3、NFK-βp65在VD大鼠大脑海马中的阳性表达较正常组明显增高。通过对VD大鼠进行针刺治疗后可以观察到VD大鼠逃避潜伏期明显缩短、成功穿越平台次数显著增多，Caspase-3、NFK-βp65的阳性表达及PTEN mRNA表达水平均有所降低。说明针刺对于改善VD的临床症状有显著效果。

总之，对VD大鼠进行头针针刺后，VD大鼠水迷宫逃避潜伏期明显缩短、成功穿越水迷宫平台次数增多，改善VD大鼠的学习、记忆能力，并有效降低VD大鼠海马Caspase-3、NFK-βp65细胞的阳性表达数及PTEN mRNA表达水平，且据观察，电针组的治疗效果更为突出，为中医临床针刺治疗 VD 提供一定的理论和实验依据。