外源酶处理对黑毛茶品质的影响研究

赵 熙，黄 浩，钟 妮，余鹏辉，郑红发

（湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125）

黑茶是湖南仅次于绿茶的第二大茶类。黑毛茶作为黑茶的原料，其品质好坏直接影响黑茶品质[1]。渥堆是黑毛茶品质形成的关键工序[2]，湿热作用和微生物酶促作用贯穿整个黑毛茶渥堆过程，其中酶促作用对黑毛茶品质的形成尤为重要，具体表现在叶绿素被破坏、多酚类氧化、果胶与糖类的水解、香气物质的形成等，最终形成了黑毛茶汤色橙黄明亮、叶底黄褐、滋味醇和、香气纯正的品质风格[3-5]。

酶工程在茶叶加工中的应用主要表现在利用酶的高效生物催化功能，促进茶叶内不利及无效成分的有益转化，改善茶叶的色香味等品质及营养价值。外源酶主要指不属于制品本身所固有的外加酶类，主要从茶鲜叶、茶幼果及其他植物或其愈伤组织中提取得到，也有些是从培养的微生物中获得[6]。现代茶叶加工中应用较多的外源酶主要有多酚氧化酶、单宁酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶等[7-9]，以达到醇和茶叶滋味、增加茶叶香气、改善茶叶品质的目的。本研究通过在黑毛茶的渥堆过程中添加纤维素酶、蛋白酶、果胶酶和淀粉酶，以期探明不同种类的外源酶对黑毛茶主要生化成分和感官品质的影响，为缩短渥堆周期、提升黑毛茶品质与质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶鲜叶来自湖南省茶叶研究所高桥实验茶场，茶树品种为湘波绿2号，鲜叶采摘时间2016年9月，采摘标准为机采一芽三、四叶；纤维素酶（200 U/mg）、蛋白酶（200 U/mg）、果胶酶（200 U/mg）和淀粉酶（10 U/mg）：宁夏和氏璧生物技术有限公司。试验用生化试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DELTA 320 pH 计、MT203T 电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热鼓风干燥箱、电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；UV-1801 双光束紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器有限责任公司；超声波清洗机：昆山美美超声仪器有限公司；恒温磁力搅拌器：江苏金坛市环宇科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

分别配制不同浓度水平的酶稀释溶液，纤维素酶浓度：A1：0.75×104U/mL、A2：1.50×104U/Ml、A3：2.25×104U/mL、A4：3.00×104U/mL、A5：3.75×104U/mL；蛋白酶浓度：B1：1.50×104U/mL、B2：3.00×104U/mL、B3：4.50×104U/mL、B4：6.00×104U/mL、B5：7.50×104U/mL；果胶酶浓度：C1：0.20×104U/mL、C2：0.40×104U/mL、C3：0.60×104U/mL、C4：0.80×104U/mL、C5：1.00×104U/mL；淀粉酶浓度：D1：0.10×104U/mL、D2：0.20×104U/mL、D3：0.30×104U/mL、D4：0.40×104U/mL、D5：0.50×104U/mL。按照液茶比（mL/g）为1 ∶50 的比例将不同浓度的酶液均匀地喷洒在揉捻叶上，用相同方式喷洒蒸馏水作为对照样（CK），将处理后的揉捻叶在同一条件下进行渥堆工艺处理，24 h 后烘干进行后续分析测定。

采用的黑毛茶加工工艺：摊青（12 h）-杀青（260 ℃、4 min）-揉捻（15 min）-渥堆（40℃、茶坯含水量65%、24 h）-烘干（90℃、90 min）-黑毛茶成品。

1.3.2 生化成分测定

水浸出物含量测定参照GB/T 8305-2013《茶水浸出物测定》方法；茶多酚含量测定参照GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》；游离氨基酸总量测定参照GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量测定》方法；可溶性糖总量测定参照蒽酮-硫酸法[10]；可溶性蛋白含量测定参照考马斯亮蓝法[10]。

1.3.3 感官品质评定

取茶样3.0 g，用150 mL 沸水冲泡，静置 5 min，重复3 次，密码审评各茶样的香气、滋味与汤色，用评分与评语相结合的方法反映其品质[11]。

1.4 数据分析处理

数据处理使用Excel 2007 和SPSS 17.0 统计分析软件。

2 结果与分析

2.1 不同浓度外源酶处理对黑毛茶品质成分的影响

2.1.1 纤维素酶处理

结果表明，不同浓度纤维素酶处理后的成品黑毛茶茶多酚和水浸出物含量有不同程度的上升趋势，游离氨基酸和可溶性蛋白含量则随纤维素酶浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，可溶性糖含量则呈现先下降后上升再下降的波浪型变化。当纤维素酶浓度为A3（2.25×104U/mL）时茶多酚含量最高，达到20.75%；当纤维素酶浓度为A4（3.00×104U/mL）时可溶性糖含量和水浸出物总量最高，分别达到6.71%和42.68%；当纤维素酶浓度为A1（0.75×104U/mL）时，游离氨基酸和可溶性蛋白含量最高，分别为2.97%和1.57%（表1）。

表1 不同浓度纤维素酶处理后主要成分变化（%）Table 1 Changes of main components after different concentrations of cellulase treatment（%）

2.1.2 蛋白酶处理

表2 结果表明，不同浓度蛋白酶处理后的成品黑毛茶可溶性蛋白、可溶性糖和水浸出物含量有不同程度的上升趋势，茶多酚和游离氨基酸含量则随蛋白酶浓度的增加呈现先下降后上升的趋势。当蛋白酶浓度为B5（7.50×104U/mL）时，茶多酚、游离氨基酸、可溶性蛋白和水浸出物含量达到最高，分别为20.39%、3.18%、1.61%和48.86%；当蛋白酶浓度为B3（4.50×104U/mL）时，可溶性糖含量最高，为9.12%。

表2 不同浓度蛋白酶处理后主要成分变化（%）Table 2 Changes of main components after different concentrations of protease treatment（%）

2.1.3 果胶酶处理

由表3 可看出，不同浓度果胶酶处理后的成品黑毛茶茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖和水浸出物含量有不同程度的上升趋势，但可溶性蛋白含量随果胶酶浓度的增加变化不大。当果胶酶浓度为C3（0.60×104U/mL）时，水浸出物含量达到最高，为47.76%；当果胶酶浓度为C4（0.80×104U/mL）时，茶多酚、游离氨基酸和可溶性蛋白含量达到最高，分别为22.58%、2.74%和1.57%；当果胶酶浓度为C5（1.00×104U/mL）时，可溶性糖含量最高，为8.62%。

表3 不同浓度果胶酶处理后主要成分变化（%）Table 3 Changes of main components after different concentrations of pectinase treatment

2.1.4 淀粉酶处理

表4 结果表明，不同淀粉酶浓度处理后，除D3（0.30×104U/mL）浓度处理外，其余浓度处理后的茶多酚含量均高于对照，且D4（0.40×104U/mL）浓度处理后的黑毛茶茶多酚含量最高，为19.80%；而不同浓度淀粉酶处理对游离氨基酸和可溶性蛋白含量影响不大，D5（0.50×104U/mL）浓度下游离氨基酸含量为2.65%，D1（0.10×104U/mL）浓度下可溶性蛋白含量为1.55%，均小幅高于对照；除D4 浓度处理外，其余酶浓度处理条件下，可溶性糖含量均高于对照，且当酶浓度为D3 时，可溶性糖含量最高，达到8.12%；当酶浓度为D5 时，水浸出物总量最高且高于对照，达到44.96%。

表4 不同浓度淀粉酶处理后主要成分变化（%）Table 4 Changes of main components after different concentrations of amylase treatment（%）

2.2 不同浓度外源酶处理对黑毛茶感官品质的影响

从表5 可以看出，纤维素酶A4（3.00×104U/mL）浓度、蛋白酶B3（4.50×104U/mL）浓度、果胶酶C3（0.60×104U/mL）浓度和淀粉酶D3（0.30×104U/mL）浓度处理的黑毛茶感官审评总分较对照样明显提高，说明适量的外源酶处理可以促进黑毛茶内含品质成分的形成，使滋味趋于纯和或醇厚，香气尚纯正或较纯正，汤色浅橙黄或橙黄明亮；但过高浓度的外源酶会导致香气和滋味带酸、汤色尚亮或浑浊，影响总体感官品质，特别是高浓度的蛋白酶对黑毛茶香气品质和汤色亮度品质影响最大。比较不同种类外源酶对黑毛茶感官品质的影响，结果表明纤维素酶处理后的黑毛茶综合感官品质最好，蛋白酶效果次之，果胶酶和淀粉酶效果相当；其中香气方面，纤维素酶处理后的效果最好，香气由尚纯正、稍闷向较纯正转化；滋味方面，外源酶处理均可在不同程度上醇化黑毛茶的滋味，其中蛋白酶效果最好，滋味由尚纯和向尚醇厚转化；汤色方面，适量的不同种类外源酶处理后均能改善黑毛茶的茶汤亮度，但随着蛋白酶浓度的增加，茶汤会出现明显浑浊现象。

表5 酶处理对黑毛茶感官品质的影响Table 5 Effect of enzyme treatment on sensory quality of raw primary dark tea

3 结论与讨论

本试验探讨了在渥堆过程中添加纤维素酶、蛋白酶、果胶酶以及淀粉酶对黑毛茶品质的影响。研究发现纤维素酶、蛋白酶、果胶酶及淀粉酶处理都能显著增加黑毛茶茶多酚、游离氨基酸、可溶性糖和水浸出物的含量，其中果胶酶对茶多酚含量变化的影响最大，蛋白酶增加游离氨基酸、可溶性糖及水浸出物含量效果最明显。对4种酶处理的黑毛茶成品进行感官审评，结果表明添加外源酶均可在不同程度上醇化黑毛茶的滋味，其中以蛋白酶效果最好，但蛋白酶浓度过高易出现酸味和茶汤浑浊现象。比较不同外源酶浓度对黑毛茶感官品质的影响，结果表明纤维素酶A4（3.00×104U/mL）浓度、蛋白酶B3（4.50×104U/mL）浓度、果胶酶C3（0.60×104U/mL）浓度和淀粉酶D3（0.30×104U/mL）浓度处理对黑毛茶感官品质改善效果最好。

纤维素酶和果胶酶作为细胞壁水解酶，能够增加细胞壁的通透性，促进游离氨基酸、多酚类物质等的溶出，提高水浸出物含量，同时纤维素酶还能降解多糖类物质，提高可溶性糖含量[12]；但同时被破坏的细胞壁总体结构还会间接地促进呼吸代谢和酶促氧化作用，加速游离氨基酸、可溶性糖、可溶性蛋白等物质的消耗和转化以及各个物质的氧化聚合作用，从而导致随着纤维素酶浓度的增大，游离氨基酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量呈现波浪型变化。蛋白酶能够促进茶叶蛋白质的水解，提高茶叶氨基酸的含量[13]。风味蛋白酶是内切酶与外端酶的复合酶，在将蛋白质降解为胨、短肽的同时，还可能降解掉不溶性多酚类聚合物以及茶多糖中的蛋白质，导致茶多酚、可溶性糖和水浸出物的增加，最终逐渐促进各物质成分在空气中的氧化过程。

与传统黑毛茶工艺相比，在黑毛茶渥堆过程中添加外源酶有望解决渥堆过程中微生物复杂难以质控的问题，可使工艺简化，缩短渥堆时间的同时更好地控制渥堆程度，提高产品质量的稳定性。本试验仅针对黑毛茶渥堆过程中添加纤维素酶、蛋白酶、果胶酶及淀粉酶取得初步研究结果，而不同茶树品种、不同季节、不同嫩度鲜叶均会对黑毛茶品质产生影响[14]，并引起对外源酶种类和需要量的变化，因此，如何根据不同条件配比适合的酶种类和数量是今后外源酶在黑毛茶加工中应用需要解决的问题之一。