槲皮素对糖尿病大鼠肾脏足细胞nephrin和podocin表达的影响

靳英丽,屈智慧,杨盼盼,袁渤雨,陈丽波

(1.吉林大学基础医学院，吉林 长春130021； 2.吉林大学第一医院；3.吉林大学中日联谊医院)

糖尿病肾病(DN)为糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一，是引起终末期肾病的重要原因。DN的特征性标志是蛋白尿，足细胞参与构成肾小球的滤过屏障，其损伤导致早期DN蛋白尿的发生，是DN发病与进展的中心靶点[1]。Nephrin、podocin是构成足细胞裂孔隔膜的关键蛋白，其中nephrin特异性地在肾小球足细胞中表达。基因突变或高糖等应激条件造成的nephrin表达减少可导致裂孔隔膜破坏和蛋白尿，因此，nephrin可作为肾小球足细胞损伤的重要标志[2]。Podocin是一种支架蛋白，对维持足细胞裂孔隔膜结构和功能的完整性起重要作用。Podocin突变或表达减少，可出现早期蛋白尿、足突融合、裂孔隔膜消失等肾脏损害[3]。

槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮，具有多种生物学活性及很高的药用价值。槲皮素广泛存在于植物的花、叶、果实中。槲皮素药理作用广泛，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、免疫调节及心血管保护作用等[4-6]，对糖尿病并发症如心血管疾病、视网膜病变、DN等有很好疗效[7-9]，愈加受到国内外研究者的关注和重视。近年来有关槲皮素抗DN的作用机制研究主要集中在对系膜细胞及肾小管上皮细胞的作用上。故本实验以糖尿病大鼠为研究对象，研究槲皮素对糖尿病大鼠肾脏功能及肾皮质足细胞裂孔膜蛋白nephrin及podocin表达的影响，探讨槲皮素的抗DN作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料动物选取SPF级雄性Wistar大鼠，体质量200-250 g，购自吉林大学实验动物中心(合格证号：SYXK(吉)2007-0011)。试剂：链脲佐菌素(STZ)规格：100 mg /支(美国Sigma-Aldrich公司)，槲皮素(10 g/支，美国Sigma-Aldrich公司)，anti-nephrin、anti-podocin、anti-β-actin、 IgG二抗(美国Abcam公司)。主要仪器：微量血糖测定仪(Free Style，美国雅培公司)，全自动生化分析仪(美国Beckman公司)，高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，电泳仪及蛋白转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2实验动物分组及模型制备雄性Wistar大鼠禁食不禁水12 h，单次腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH 4.2)。注射STZ 后72 h尾尖采血，微量血糖测定仪检测随机血糖，以血糖浓度≥16.7 mmol/L确定为糖尿病模型制备成功，未达标准大鼠弃去不用。造模成功的大鼠随机分为糖尿病模型组(Diabetic model，DM，n=8)，槲皮素给药组(Qu,n=8，剂量100 mg/kg/d)。槲皮素给药方式为灌胃给药，按上述剂量每日1次，共12周；正常对照组(CON，n=8)以等体积枸橼酸缓冲液代替STZ及槲皮素给药。

1.3标本采集实验结束前1 d，各组大鼠用代谢笼收集24 h尿液，留用测定24 h尿中总蛋白、白蛋白、尿素和肌酐水平。大鼠空腹8 h后称重，乙醚麻醉后腹主动脉取血、分离血清，待测血肌酐、尿素水平。摘取肾脏，去除被膜后称重。去除肾脏髓质，皮质放入液氮中速冻后转移到-80℃保存。

1.4肾脏指数的计算及血、尿生化指标测定各组大鼠称量体质量和肾脏湿重，计算肾脏肥大指数(肾重/体质量，KW/BW)。用全自动生化分析仪对采集的血液样品进行血肌酐、尿素的检测，对采集的尿液样品进行尿总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素水平检测。

1.5Westernblot方法检测肾皮质nephrin和podocin的蛋白表达称取10 mg冰冻肾皮质，在100 μl冰预冷的悬浮缓冲液中将组织剪碎，加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液，混合后置于沸水浴中加热5 min，超声处理仪剪切。10 000×g离心10 min，取上清液进行BCA法蛋白定量，取50 μg总蛋白的组织裂解产物进行12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。湿转至硝酸纤维素膜后置于封闭液中，室温封闭1-2 h，TBS漂洗膜3次，分别加anti-nephrin、anti-podocin、anti-β-actin进行一抗孵育，加辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊二抗，放入摇床室温摇动1 h，漂洗后ECL显色，拍照。Western条带用Quantity one软件分析。结果以目的蛋白OD值与内参β-actin的OD值比值表示。

2 结果

2.1槲皮素对糖尿病大鼠肾脏指数及血中肌酐、尿素水平的影响

糖尿病模型分组给药 12周后，检测大鼠肾脏指数、血肌酐及尿素，结果如表1所示，与正常对照组相比，糖尿病模型组肾脏指数、血肌酐和血尿素氮水平较正常对照组明显升高(P<0.01)，提示肾脏肥大、肾功能受损；槲皮素给药12周后，槲皮素给药组与糖尿病模型组相比，肾脏指数降低(P<0.05)、血肌酐和尿素明显降低(P<0.01)。

表1 槲皮素对糖尿病大鼠肾脏指数及血肌酐、尿素水平的影响

注：与正常对照组比较*P<0.05，* *P<0.01；与糖尿病模型组比较#P<0.05，# #P<0.01。

2.2槲皮素对糖尿病大鼠24h尿中总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素水平的影响

分组给药12周后，检测大鼠24 h尿总蛋白、白蛋白、尿中肌酐、尿素含量，结果如表2所示。与正常对照组相比，糖尿病模型组24 h尿总蛋白、白蛋白明显升高(P<0.01)；尿中肌酐和尿素水平明显降低(P<0.01)；槲皮素给药 12周后，槲皮素给药组与糖尿病模型组相比，24 h尿中总蛋白和白蛋白水平都明显降低(P<0.01)，尿中肌酐和尿素水平升高(P<0.05)。

表2 槲皮素对糖尿病大鼠尿中总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮水平的影响

注：与正常对照组比较*P<0.05，* *P<0.01；与糖尿病模型组比较#P<0.05，##P<0.01。

2.3槲皮素对糖尿病大鼠肾皮质足细胞nephrin和podocin蛋白表达的影响

采用Western blot方法检测nephrin和podocin在各组大鼠肾皮质中的蛋白表达变化情况。结果显示，糖尿病模型组足细胞标志蛋白nephrin和podocin表达明显比正常对照组下降，槲皮素治疗组肾皮质nephrin和podocin表达水平高于糖尿病模型组(图1)。

注：CON：正常对照组，DM：糖尿病模型组，QU：槲皮素给药组。 * *与正常对照组比较，P<0.01；#与糖尿病模型组比较，P<0.05。

3 讨论

我国是全世界糖尿病发病的第一大国，约有1/3病例会发展为DN，是引起终末期肾病的重要原因。目前DN尚无特效治疗药物，故探索DN发病机制及寻找安全有效的抗DN新药具有十分重要的意义。

已知100 多种中草药中含有槲皮素，其广泛存在于植物的花、叶、果实中，如槐米、槐花、丹皮、菊花、田基黄、车前子等。槲皮素药理作用非常广泛，包括对DN的作用。本研究中，我们给予糖尿病大鼠槲皮素灌胃12周之后进行肾脏指数及肾功能相关指标的检测。结果表明，槲皮素给药组的24 h尿中总蛋白和白蛋白水平都较糖尿病模型组明显降低(P<0.01)，尿中肌酐和尿素水平升高(P<0.05)。槲皮素给药组的肾脏指数、血肌酐和尿素较糖尿病模型组降低。结果提示槲皮素改善了糖尿病大鼠的肾功能、减轻了蛋白尿。

糖尿病肾病的病理特点包括持续加重的蛋白尿、肾脏肥大、肾小球基底膜增厚、肾小球硬化等。蛋白尿在DN的进展过程中起着关键作用，足细胞附着在肾小球基底膜外侧，足突之间的裂孔隔膜构成肾小球滤过的最后一道屏障。足细胞损伤会导致蛋白尿的发生，进而引起肾小球硬化纤维化并最终进展为终末期肾病。在糖尿病肾病条件下，高血糖可直接损伤足细胞造成足细胞肥大、足突变宽融合、足细胞数目减少等病理现象[10]。槲皮素是如何发挥对糖尿病大鼠肾脏保护作用、减轻蛋白尿的呢？有关槲皮素抗DN作用机制的研究主要集中在药物对系膜细胞及肾小管上皮细胞的作用上。有学者发现槲皮素通过调节TGF-β/Smad信号通路而抑制高糖下系膜细胞的增殖和细胞外基质积聚[11]，也有学者发现槲皮素通过抑制mTORC1/p70S6K信号通路减轻糖尿病肾病的肾小管上皮细胞间质化和肾纤维化[12]。

在本研究中，我们研究了槲皮素对肾小球足细胞的影响，即对足细胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表达的影响。结果表明，糖尿病大鼠肾脏组织中nephrin和podocin表达较正常对照组明显降低。而槲皮素给药后大鼠肾脏组织中nephrin和podocin表达较糖尿病模型组明显升高。结果提示在糖尿病肾病时存在足细胞损伤，槲皮素可以在一定程度上增强裂孔膜蛋白nephrin和podocin表达。由此，我们判断槲皮素可能通过增强nephrin和podocin的表达，从而改善DN时足细胞损伤，进而减轻蛋白尿、发挥抗DN作用。