黑果枸杞转录组SSR信息分析及分子标记开发

尹 跃，安 巍，赵建华，王亚军，樊云芳，曹有龙

（宁夏农林科学院 国家枸杞工程技术研究中心，宁夏 银川750002）

黑果枸杞Lycium ruthenicum是茄科Solanaceae枸杞属Lycium植物，主要分布在中国西北地区［1］，野生种质资源非常丰富，耐干旱耐盐碱；其果实富含类黄酮、花青素、多糖、酚酸和脂肪酸等生物活性物质，具有预防多种疾病的功效［2］，深受消费者喜爱。目前，对黑果枸杞果实活性物质的研究较多［2-3］。也有研究利用扩增片段长度多态性（AFLP）［4］，简单重复序列间扩增多态性（ISSR）［5］和相关序列扩增多态性（SRAP）［6］标记进行遗传多样性评价，但鲜有利用简单重复序列（SSR）标记的报道。SSR标记是基于生物基因组中由1～6个核苷酸组成的串联重复序列特性开发的分子标记，具有多态性丰富、高通量检测、共显性遗传等优点，已广泛应用遗传图谱构建、分子标记辅助育种、种质资源鉴定和遗传多样性分析等［7-10］领域。由于缺乏基因组信息，基于基因组测序开发黑果枸杞SSR标记成本高，步骤繁琐［11-12］，SSR标记在黑果枸杞种质资源研究中的应用受到限制。同时，美国生物技术信息中心（NCBI）中公布的黑果枸杞表达序列标签（EST）极少，除了CHEN等［16］研究了基于盐胁迫下黑果枸杞转录组表达序列标签-简单重复序列（EST-SSR）标记开发之外，基于转录组测序黑果枸杞EST-SSR标记开发尚未见报道。EST-SSR来源于表达的基因组区域，可直接反映相关基因多样性，在不同物种间具有良好的通用性；随着高通量测序技术和生物信息学方法快速发展，基于转录组测序已开发刺梨Rosa roxburghii，中国樱桃Cerasus pseudocerasus，马铃薯Solanum tuberosum等［13-15］多种植物的SSR标记。本研究以前期黑果枸杞抗旱转录组测序获得的数据为基础，利用生物信息学方法批量开发EST-SSR标记，并分析其分布特点、组成特征，以期为黑果枸杞种质资源遗传多样性分析研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 转录组数据来源

取1年生黑果枸杞持续干旱胁迫下的叶和根，提取RNA后进行转绿组测序（无参，HiSeqTM2500，北京诺禾致源生物信息科技有限公司），共12个样本，计80 G数据。利用Trinnity等软件［17］对测序的数据进行拼接和组装，获得213 058条单基因簇（unigene）作为背景数据进行分析。

1.2 植物材料及DNA提取

用于SSR引物筛选及评价的24份枸杞种质资源（表1）均来自宁夏农林科学院国家枸杞工程技术研究中心枸杞种质资源圃（38°38′49″N， 106°9′10″E）。 利用天根试剂盒（DP5-02， 天根）提取基因组DNA。

1.3 转录组SSR位点鉴别及引物设计

使用MISA软件（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）搜索Unigene序列的SSR位点。搜索标准为：重复单元长度1～6 bp，单核苷酸重复次数≥10次，二核苷酸重复次数≥6次，三、四、五、六核苷酸重复次数≥5次，复合型SSR位点碱基间隔≤100 bp。

采用BatchPrimer 3软件（https://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/）对获得的SSR位点批量设计引物。引物设计参数为：引物长度18～27 bp（最佳22 bp），GC为40%～70%（最适50%），退火温度为50～60℃（最适55℃），PCR扩增产物长度为100～300 bp，其他参数为默认设置。

1.4 EST-SSR引物筛选及验证

随机挑选128对引物，在上游引物 5′端添加18 bp的 M13通用引物序列（TGTAAAACGACGGCCAGT），3′端保持不变，用FAM荧光集团修饰后，由英潍捷基贸易有限公司合成。

PCR扩增体系（15.0 μL）：DNA模板1.0 μL，M13通用荧光引物0.1 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL， 2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL， 双蒸水 5.6 μL。 PCR 扩增在 ABI-2720（应用生物系统公司， 美国）上进行。扩增程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60～45℃ 30 s，72℃ 30 s，15个循环；95℃ 30 s，50℃30 s，72℃30 s，20个循环；72℃7 min。扩增产物经过ABI3730XL DNA（应用生物系统公司，美国）检测，用LIZ500作为分子量内标。

表1 供试种质材料信息Table 1 Information of twenty-four materials used in this study

1.5 数据分析

以SSR出现频率和SSR平均分布距离描述EST-SSR。公式如下：①SSR出现频率fc＝c/n×100%，其中c为搜索到的SSR数量（个），n为无余EST数量（个）。②SSR平均分布距离fN＝N/c，其中N为无余EST数量的总碱基数（个）。由GeneMapper 4.0软件获得扩增产物片段大小，用DataFormater 2.7软件［18］将数据转化为PowerMarker v3.25软件［19］的输入格式，计算等位基因数（number of alleles，NA）、主效等位基因频率（major allele frequency,fMA）、 期望杂合度（expected heterozygosity，HE）、 观察杂合度 （observed heterozygosity，HO）和多态信息量（polymorphism information content，CPI）。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞转录组中SSR位点的分布特点

利用MISA软件对黑果枸杞转录组测序获得的213 058条Unigene（序列总长度为262 643 598 bp）序列进行搜索，发现其中56 170条Unigene序列中含有73 896个SSR位点，其中13 611条Unigene含有2个或2个以上EST-SSR位点。总体上，SSR发生频率为26.36%，平均3.55 kb出现1个SSR位点。SSR类型丰富，单核苷酸至六核苷酸重复类型均存在；单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复出现频率占优势，分别占总SSR的74.33%，13.30%和11.81%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型数量较少，分别占总数的0.49%，0.03%和0.04%（表2）。

表2 黑果枸杞转录组SSR数量、类型和频率Table 2 Frequencies of the different SSR repeat motif types observed in the Lycium ruthenicum transcriptome

2.2 转录组SSR基序重复类型和频率特征

从黑果枸杞转录组SSR核苷酸基序重复类型来看，73 896个SSR位点共有84种重复基元，单核苷酸至六核苷酸重复分别有2，4，10，26，18和24种。从出现的频率来看（表3）：占优势的前3种重复单元类型是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复基元；单核苷酸重复基元以A/T为主，占该类型SSR位点总数的95.64%；二核苷酸主要以AG/CT为主，占二核苷酸总数的40.42%，其次是AT/AT，AC/GT和CG/CG，分别所占比例为35.37%，23.74%和0.46%；三核苷酸重复单元以AAC/GTT，AAG/CTT，AAT/ATT，ATC/ATG和ACC/GGT为主，占所有三核苷酸重复单元的75.88%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复单元类型较为分散，出现频率相对较低，仅为0.56%。

表3 黑果枸杞EST-SSR中重复基元的类型、数量及频率Table 3 Number and frequencies of repeat motif types in Lycium ruthenicum

2.3 SSR引物有效性及多态性检测

为检测所开发的EST-SSR标记的可用性，对56 170条Unigene序列的73 896个EST-SSR位点设计引物，共得到引物12 674对。随机挑选128对（包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸），以表型性状差异较大的 ‘黑果枸杞’ ‘宁杞1号’ ‘宁杞菜1号’和 ‘中国枸杞’的DNA为模板进行PCR扩增，其中74对引物能扩增出清晰的扩增产物，引物扩增有效率为57.8%；其中28对引物具有多态性，多态性引物占有效引物的37.8%。图1为引物LM-02对4份种质的基因型图。

2.4 SSR位点遗传多样性分析

以筛选的28对多态性引物对24份枸杞种质作遗传多样性分析。共检测到等位基因256个，各引物检测到的等位基因为4～19个，平均为9.1个；共检测到基因型数303个；主效等位基因频率变化范围为0.188～0.729，平均值为0.432；观察杂合度为0.167～0.833，平均值为0.439；期望杂合度为0.433～0.904，平均值为0.712，多态信息量为0.395～0.897，平均值为0.678。由Botstein理论［20］判定（表4），在开发出的28个多态位点中有24个高度多态位点（CPI≥0.5），4个中度多态位点（0.25≤CPI＜0.5）。

3 讨论

本研究搜索了黑果枸杞的213 058条Unigene序列，发现其中的56 170条中含有73 896个SSR位点，发生频率为26.36%；高于中国樱桃Cerasus pseudocerasus（15.62%）［14］，马铃薯Solanum tuberosum（3.43%）［15］， 夏蜡梅Sinocalycanthus chinensis（21.25%）［16］， 马尾松Pinus massoniana（4.69%）［23］和中间锦鸡儿Caragana intermedia（14.78%）［24］， 低于蓝靛果忍冬Lonicera caeruleavar.edulis（32.51%）［25］， 山桐子Idesia polycarpa（35.00%）［26］， 普通油茶Camellia oleifera（39.67%）［27］和芙蓉李Prunus salicina（54.51%）［28］。可见，不同物种转录组SSR位点的出现频率不同，出现差异的原因除了物种本身差异，还可能与分析数据库大小、SSR挖掘工具及搜索条件有关［13］。

从重复单元频率来看，黑果枸杞转录组的SSR主要类型为单核苷酸重复基序（74.33%），其次为二核苷酸重复（13.30%）和三核苷酸重复（11.81%）。研究发现：多数植物中EST-SSR以二核苷酸和三核苷酸为主，但主要的重复基序类型不同［29］。推测原因可能与SSR搜索参数设置有关，多数植物在进行SSR位点搜索时并未将单核苷酸重复设置为搜索对象［13-14］。

本研究从213 058条Unigene序列中鉴定出73 896个SSR位点，丰富了黑果枸杞EST-SSR标记的数量。为了进一步评估这些EST-SSR引物的质量，从设计到的12 674对EST-SSR引物中随机挑选出128对引物，54对引物未能扩增出产物，原因可能是扩增产物中存在大量内含子或引物设计不合理［30-31］；有74对引物成功扩增出产物，引物扩增有效性达57.8%，表明开发的引物质量较高，对后续黑果枸杞种质资源遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等均有应用价值。

图1 4个样本在LM-02位点的基因型Figure 1 Genotypes of 4 samples at LM-02 site

表4 28对EST-SSR引物对枸杞种质的遗传多样性检测Table 4 Genetic diversity of 24 wolfberry germplasm revealed by 28 EST-SSR markers