内质网膜蛋白复合物10(EMC10)的研究进展

陈匡阳(综述) 王宣春(审校)

(复旦大学附属华山医院内分泌科-复旦大学内分泌糖尿病研究所 上海 200040)

内质网膜蛋白复合物(endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC)是一种多功能、多亚基的蛋白质复合物,目前在脊椎动物中已经发现EMC1-7、8a、8b、10。在蛋白质组学研究中发现EMC参与内质网相关蛋白质的降解(ER-associated degradation)[1]、与线粒体形成内质网-线粒体栓[2]、多跨膜蛋白质的正确装配[3]等细胞内多种生物活动过程。EMC基因在物种进化过程中具有高度保守性[2,4-5]:EMC不仅在真菌和动物中有所表达,在古虫、变形虫、绿藻、植物、不等鞭毛类、囊泡虫类、有孔虫界、定藻门等多种微生物中均能找到EMC的同源基因。

人内质网膜蛋白复合物10(endoplasmic reticulum membrane protein complex subunit 10,EMC10)具有两种异构体:分泌型EMC10 (EMC10-1和膜型EMC10 (EMC10-2)。在研究人胰岛素瘤组织时,通过测序及构建cDNA文库,本课题组[6]曾筛选出人EMC10-1的全长cDNA,将其编码的蛋白质命名为INM02(insulinoma 02),发现该蛋白质也参与胰岛素瘤组织的分泌通路,同时预测该蛋白质含有一段信号肽。随后我们研究INM02的功能,证实胰岛β细胞中EMC10-1的分泌受葡萄糖调节[7]。虽然最初认为酵母中只含EMC1-6[8],但EMC10同源基因YDR056C后续也在啤酒酵母中被发现[5],且进化分析提示大多数菌类都存在EMC10同源基因。可见与EMC家族其他蛋白质相同的是,EMC10基因在物种进化中也具有高度保守性。本文从基因特点、蛋白结构到生物学功能,对EMC10基因和蛋白质进行介绍,为进一步研究EMC10在生命活动中的功能机制提供支持。

EMC10基因特点人EMC10基因位于19号染色体长臂上(19q13.33),全长约16.5 kb,人EMC10蛋白有2个同源异构体,即EMC10-1和EMC10-2。EMC10-1和EMC10-2基因均由12个外显子组成,长约3 kb,而完全编码序列(coding sequence,CDS)均由7个外显子组成,仅最后一个外显子有所差别[4]。EMC10-1基因的CDS长度为765 bp,编码254个氨基酸,EMC10-2基因的CDS区长度为789 bp,编码262个氨基酸。根据发现时的不同特点,EMC10-1又命名为INM02[7]、HSS1[4]、Mitra22[9]及C19orf63[4,10]等,EMC10-2又命名为HSM1[4]。

EMC10蛋白结构特点人EMC10-1是由254个氨基酸组成的分泌蛋白质,其N-端具有一段长度为27个氨基酸的信号肽,但不含跨膜区[4,10]。人EMC10-2是由262个氨基酸组成的单次跨膜蛋白质,包含一个胞外N-端信号肽(信号肽由27个氨基酸组成)、一个跨膜区(19个氨基酸组成)和一个多聚甘氨酸尾C-端。本课题组[7]用ELISA方法成功检测到人血清中的 EMC10-1(即INM02)。Junes-Gill等[4]等用带有6*His tag的EMC10-1重组质粒瞬时转染293T细胞,用Western blot方法在培养细胞的无血清培养液中也检测出了EMC10-1蛋白。Reboll等[10]等分别将EMC10-1和EMC10-2的过表达质粒转染至293细胞后,用免疫沉淀方法发现EMC10-2仅存在于细胞裂解产物中,而EMC10-1在细胞裂解产物和细胞培养液中均能检测出,去除EMC10-1信号肽端或者在EMC10-1过表达质粒转染液中加入蛋白质转运抑制剂Brefeldin A,则无法再在细胞培养液中检测出EMC10-1。以上研究结果均证明EMC10-1是一种分泌蛋白质,而EMC10-2是一种跨膜蛋白质。

经预测,EMC10-1蛋白多肽链的第182和第198个氨基酸位置可能为糖基化位点,使用不同的糖链水解酶分别对细胞内的EMC10-1蛋白和分泌至上清液中的EMC10-1蛋白进行处理,发现前者的分子量并未减少,而后者的蛋白质表观分子量逐渐减少,提示该蛋白质在分泌过程中伴随着复杂的糖基化修饰过程[4]。

对EMC10-1/EMC10-2蛋白序列的三维结构进行预测,发现该蛋白质和一种人工合成的蛋白质TOP-7在三维结构上具有同源性[4,15],这种人工合成的蛋白质在极端温度和pH环境下均具有稳定性,提示EMC10蛋白质在物理特性上也可能存在类似的稳定性。

EMC10蛋白分布特点本课题组曾以SD大鼠为研究对象,克隆大鼠同源EMC10-1 (INM02)基因,研究EMC10-1 mRNA在组织中的分布情况[7],Northern blot结果显示EMC10-1 mRNA在大鼠组织中广泛表达,尤其是胰腺组织、睾丸组织和膀胱组织中。在胰腺组织中,免疫组化进一步显示EMC10-1主要集中于胰岛细胞,而几乎不存在于胰腺的外分泌组织。Junes-Gill等[4]用EMC10-1过表达质粒转染人胶质瘤细胞株A172细胞后,免疫组化显示EMC10也定位于细胞核,提示EMC10-1可能与成纤维细胞生长蛋白、表皮生长因子一样,同时具有细胞内和细胞外功能特性[16]。小鼠分泌型EMC10也广泛分布于脑组织的神经元中,主要存在于神经元胞体中,同时在囊泡、树突轴中也有所表达[9]。Delgado-vega等[17]发现EMC10虽然在全身各组织均有分布,但在肾上腺、心耳、肾皮质、垂体、骨骼肌、子宫、睾丸中表达较多,其中在垂体中表达量最高。

EMC10蛋白的生物学功能

EMC10-1影响糖代谢 本课题组[7]前期研究中用高糖(25 mmol/L)和低糖(5.5 mmol/L)对胰岛细胞系(Min6细胞)、原代胰岛细胞干预不同时间,分别测定EMC10-1的mRNA和蛋白质水平。干预24和48 h时,无论在Min6细胞还是胰岛细胞中,高糖干预组的EMC10-1 mRNA和蛋白质水平均明显高于低糖干预组。实验表明高糖能增加胰岛细胞和Min6细胞中胰岛素的表达,为了排除胰岛素对EMC10-1表达的影响,将Min6细胞和胰岛细胞用不同浓度的胰岛素处理,结果发现各组EMC10-1 mRNA水平并无差异。由此推测EMC10-1的表达和分泌一定程度上受血糖浓度的影响,这种分泌模式可能与血糖调节胰岛素分泌的模式相似,但EMC10-1的表达和分泌不受胰岛素的影响。

用核磁共振氢谱(1H-NMR)方法检测EMC10敲除小鼠的血浆,发现雌性小鼠血浆中的β-羟丁酸和2,3-丁二醇明显增加,而用传统的临床化学方法和组织病理方法并未发现EMC10敲除小鼠血浆中生化指标的任何改变[18]。临床研究发现胰岛素瘤患者血浆中的β-羟丁酸浓度也明显升高[19-20],胰岛素瘤患者具有高胰岛素血症和低血糖的特点,机体血糖浓度降低,脂肪动员增加,会引起酮体增多。糖尿病患者胰岛素分泌相对或绝对不足,外周组织糖利用障碍,同样会造成脂肪动员增加,当胰岛素补充不足、血糖控制不佳时,就会出现糖尿病酮症酸中毒。这些都与1H-NMR方法检测到的EMC10敲除小鼠血浆中β-羟丁酸的变化相一致,由此推测EMC10基因的敲除可能对糖代谢过程产生影响,但是这种影响虽然造成血浆中β-羟丁酸升高,却还未达到引起酮血症的程度。

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EMC10-1抑制胶质瘤生长 Junes-Gill等[4,11]从纯化的人造血干细胞中克隆到EMC10-1,将其命名为HSS1,并将其另一个膜型剪切异构体EMC10-2命名为HSM1。体外研究发现,EMC10-1过表达使胶质瘤细胞株的增殖减少、接触抑制减弱。对EMC10-1过表达胶质瘤细胞周期进行分析发现,在A172和U87胶质瘤细胞系中,处于G0/G1期的细胞数均减少,而在A172细胞中处于S期和G2/M期的细胞数增多,由此推测EMC10-1并非特异性调节细胞周期某个环节,而是总体上延长增殖时间。

与对照组相比,EMC10-1过表达使胶质瘤细胞软琼脂集落形成数明显减少,集落大小明显减小,因细胞形态改变与恶性肿瘤形成有关,该结果提示EMC10-1能减轻胶质瘤细胞的恶性程度,有恢复细胞接触抑制的趋势。将胶质瘤细胞U87和过表达EMC10-1的U87细胞分别移植入免疫缺陷小鼠,后者存活时间更长,提示EMC10-1在体内也能减少胶质瘤细胞的恶性程度。因为肿瘤新生血管内皮形成是转移和侵袭的重要环节,将EMC10-1过表达的胶质瘤细胞与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培养,EMC10-1抑制了HUVECs的侵袭和转移。用EMC10-1直接干预HUVECs得到相同的结果,表明EMC10-1会抑制内皮细胞的新生血管形成。

EMC10-1不仅能抑制胶质瘤细胞株的增殖、迁移及侵袭,还能够抑制内皮细胞的新生血管形成,提示EMC10-1是治疗恶性胶质母细胞瘤潜在的靶点。

EMC10影响神经元发育 构建Df(16)A+/-小鼠模型以模拟人22q11.2染色体微缺失引起的精神异常和认知功能障碍[21-23],发现Df(16)A+/-小鼠海马体和脑皮质中miRNA-185表达较正常小鼠减少70%～80%,而EMC10-1基因表达明显上调。

与之相同的是,EMC10基因的表达在Dgcr8+/-小鼠中也明显上调,已知DGCR8对miRNA的合成具有重要作用,22q11.2微缺失也会导致DGCR8基因受影响[24],因此提示Df(16)A+/-小鼠EMC10表达上调可能与miRNA的失调有关。miRNA虽然并不编码氨基酸,但对mRNA的稳定和转录有调节作用[25-28]。进一步研究发现EMC10是miRNA-185作用的下游靶蛋白,miRNA-185下调会引起EMC10表达增加,且miRNA-185减少会引起神经元树突和树突棘发育受损,增加miR-185活性则能逆转Df(16)A+/-小鼠表现出的神经元轴突及树突棘发育障碍。实验证明增加EMC10表达水平,野生型小鼠海马体神经元树突和树突棘发育受损增加,初级神经元的树突和总分支点的数量减少,而减少神经元EMC10的表达能部分挽救神经元树突和树突棘发育的缺陷。动物实验证明,减少EMC10的表达能增加Df(16)A+/-小鼠胚胎发育时期神经元轴突和树突棘形成,这与婴儿脑组织中EMC10表达水平较低相一致[29]。

为进一步探究降低EMC10表达水平能否恢复Df(16)A+/-小鼠所表现出的认知和行为异常,该课题组[30]又构建了Df(16)A+/-/Emc10+/-小鼠。已知Df(16)A+/-小鼠和精神分裂症患者一样会出现兴奋性增高、前脉冲抑制(prepulse inhibition decrease,PPI)减少、工作记忆(working memory,WM)异常、社会记忆(social memory,SM)缺失、联想记忆(associative memory,AM)缺失的表现,而Df(16)A+/-/Emc10+/-小鼠能挽救Df(16)A+/-小鼠表现出的PPI减少、WM异常和SM缺失,但是无法改善兴奋性增高、联想记忆缺失的症状。降低EMC10的表达还能恢复Df(16)A+/-小鼠前额皮层突触可塑性,预防神经元结构改变。

由此可见,EMC10对于胚胎发育时期神经元树突和树突棘结构的成熟和发育具有抑制作用,且EMC10基因的表达受miRNA-185的调节,正常状态下miRNA-185限制EMC10基因的表达,以避免后者在胚胎发育期对神经发育产生抑制。动物实验证实,EMC10基因缺失能部分挽救精神分裂症的症状,这可能也与EMC10抑制成年期神经回路正常有关。

EMC10-1/EMC10-2促进缺血心肌的组织修复Reboll等[10]对急性心梗(acute myocardial infarction,AMI)患者骨髓细胞进行分泌蛋白质组学分析的时候发现,分泌蛋白EMC10-1具有血管形成的生物学活性。

过表达EMC10-1和EMC10-2使内皮细胞增殖增加、划痕实验刮痕处的修复率增加,这种增加效应与血管内皮生长因子的效应相当。去除EMC10-1和EMC10-2的信号肽段则上述促血管形成现象消失,提示EMC10的两种变构体均需通过分泌途径发挥促进血管形成的作用。用重组EMC10 (3、10、30、100、300 ng/mL)直接干预人冠脉内皮细胞,也有相同的促血管形成作用,且EMC10的促血管形成作用具有浓度依赖性。

信号通路研究发现,EMC10通过依次激活小G蛋白、PAK2、p38 MAPK、MK2、HSPB1的磷酸化,促进肌动蛋白聚合和内皮细胞迁移。该信号通路被相应抑制剂所阻断时,EMC10促进内皮细胞刮痕修复作用也被抑制。用AMI小鼠模型的心梗和非心梗组织进行体外实验,发现EMC10能促进前者内皮细胞生长,这种作用不仅与血管内皮生长因子的作用相当,而且能被p38 MAPK抑制剂所阻断。EMC10对于MK2基因敲除小鼠的心梗组织无促内皮细胞生长的作用。

进一步研究发现,小鼠心梗后3天,EMC10-1和EMC10-2在心梗组织和血浆中的含量均明显增加。流式细胞术分析显示,心梗区单核细胞和巨噬细胞中的EMC10表达明显多于中性粒细胞、T细胞、B细胞及内皮细胞。无论在心梗模型还是假手术模型中,骨髓、脾脏、外周血中的单核细胞和巨噬细胞EMC10-1/EMC10-2表达量均多于其他细胞。分离心梗模型小鼠心梗区、骨髓、脾脏中的单核细胞,培养24 h,在3种来源的单核细胞上清中均能检测到EMC10-1。由此推测心梗后的EMC10主要由单核细胞和巨噬细胞分泌。

Emc10-/-小鼠心梗区的新生毛细血管密度、p-HSPB表达量明显少于野生型(wild type,WT)小鼠,其心梗面积、左室重塑、心肌收缩功能紊乱都比WT小鼠严重。将WT小鼠的骨髓细胞移植给EMC10-/-小鼠可以增加后者体内EMC10的表达、心梗区血管形成,改善左室重塑和心肌收缩功能。但将EMC10-/-小鼠的骨髓移植给WT小鼠,则会损伤WT小鼠心梗后新生血管形成、增加梗死面积、加剧左室重塑和心肌收缩功能紊乱。用EMC10 (10 μg/天)干预治疗心梗小鼠7天后发现,毛细血管密度、p-HSBP1表达量、再灌注毛细血管数均有所增加,心梗面积减少、左室重塑和心肌收缩功能紊乱减轻,这种作用能维持到心梗后28天。

作为一个骨髓源性血管形成生长因子,EMC10主要由单核细胞和巨噬细胞分泌,通过小G蛋白-PAK2-p38 MAPK-MK2-HSPB1信号通路,发挥其促进心梗后新生血管形成的作用,EMC10短暂的干预治疗有望为治疗AMI赢得时间窗。动物实验表明,AMI 3天后小鼠血浆和心梗区EMC10的2个同源异沟体含量均明显升高,提示EMC10可能具有预测心梗的潜在价值。

EMC10调控精子成熟和雄性生育 本课题组前期构建了EMC10基因敲除小鼠模型[31],在研究纯合子小鼠的表型过程中发现EMC10-/-雄性小鼠完全不育,EMC10-/-雌性小鼠生育力下降,因此进一步探究了EMC10在调控精子成熟和雄性生育过程所发挥的作用。

体外授精实验结果显示,无论是否去除卵母细胞外的透明带,EMC10-/-精子均无法使卵母细胞受精而发育到二细胞阶段,而通过胞浆内单精注射技术,EMC10-/-精子能使卵子受精并发育成正常的胚胎,提示EMC10参与精卵的受精过程。

与WT小鼠相比,Emc10-/-小鼠的附睾重量以及睾丸和附睾形态结构均无明显异常,但EMC10-/-精子运动能力显著下降、获能受到抑制、自发顶体反应数量减少,从附睾分离出的EMC10-/-精子在体尾结合处出现发夹样折叠,而睾丸分离的精子并未出现这种形态学上的异常。表明EMC10不影响精子发生,也不影响睾丸和附睾的发育,但对精子在附睾中的成熟和维持精子从睾丸移动到附睾过程中的正常形态具有重要作用。

蛋白质组学分析和Western blot检测均发现,EMC10缺乏会导致Na/K-ATP酶的α亚基ATP1A4和β亚基ATP1B3表达几乎完全缺失,造成EMC10-/-精子内的Na+浓度显著升高。用含有HCO3-的培养液孵育EMC10-/-精子和WT小鼠的精子,发现HCO3-诱导的pH值升高在EMC10-/-精子被明显抑制。因此,EMC10对于维持精子细胞内Na+和HCO3-平衡有重要作用。

临床样本检测发现,弱精症患者精液中的EMC10蛋白质表达水平较正常组下降,EMC10蛋白质表达水平与精子运动能力呈正相关,可见EMC10参与人精子运动能力的调节过程,精子中EMC10水平的降低可能是男性不育的原因之一。

EMC10通过影响精子的运动能力、顶体反应、精子获能和精子的正常形态,在雄性生育中发挥必要作用。EMC10可维持精子细胞内Na+和HCO3-平衡,这被认为是EMC10调控雄性生育能力的重要机制。弱精子症患者的精子中EMC10表达减少,而EMC10表达与精子运动力呈正相关性,这使EMC10有望成为男性不育的生物学标志物和潜在的药物治疗靶点。对精子成熟过程发挥主要作用的是EMC10-1还是EMC10-2,仍需进一步研究。

结语综上所述,虽然EMC10-1和EMC10-2在氨基酸组成上仅相差8个氨基酸,但是所发挥的生物学功能不尽相同。目前对于EMC10的研究主要集中于其作为分泌蛋白质的功能研究,主要涉及糖代谢、肿瘤生长、神经系统疾病、心血管疾病、雄性不育方面。EMC10基因与多种自发免疫性疾病相关基因存在相互作用关系[17],SLE患病基因与FAM71E1/EMC10基因在人群和家族水平呈连锁不平衡性。

不同浓度EMC10对于血管生成可能具有相反作用。Junes-Gill等[11]在研究胶质瘤时发现,与对照组相比,浓度为200和500 nmol/L的EMC10对血管形成有抑制作用的,且浓度500 nmol/L时的抑制作用更明显,而Reboll等[10]发现EMC10能促进小鼠心梗区新生毛细血管形成。因此推测,EMC10对血管形成的作用与浓度有关,在浓度较低时具有促血管形成作用,而在浓度较高时则抑制血管形成。

EMC10作为内质网膜蛋白复合物家族的一员,是否参与内质网蛋白质的折叠或降解过程？ EMC10的另一个变构体EMC10-2主要发挥何种生物学功能？全面研究EMC10的生物学功能将为了解代谢性疾病、精神疾病、神经发育障碍、心梗组织修复、男性不育提供新思路,阐明EMC10与疾病相关的作用模式,将为治疗疾病提供新的治疗靶点。