聚肌胞苷酸对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞TLR3信号通路的影响

龚 军 路翔宇 熊 伟 许 建 张 浩 俞小炯

（四川省医学科学院·四川省人民医院肝胆胰外 四川 成都 610072）

聚肌胞苷酸（polyinosinic polycytidylic acid，Poly I：C）为Toll样受体3（TLR3）的特异性配体，且TLR3对TRIF依赖性信号通路专一介导。大量研究发现[1-4]，TLR3的特异性激动剂Poly I：C在体内外对缺血缺氧的神经细胞均有保护作用。研究发现[5-8]，Poly I：C对脑缺血损伤小鼠的神经细胞具有保护作用，并且可增加脑缺血小鼠及体外氧糖剥夺损伤处理的星形胶质细胞TLR3-TRIF信号通路下游IFN-3的表达起到抑制炎症反应的作用。但现阶段尚未明确其具体作用机制，因此本研究采用Western blot检测氧糖剥夺损伤星形胶质细胞模型TLR3信号通路中的相关蛋白质表达的变化，进一步探讨Poly I：C对神经细胞的保护作用机制。

1.材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

SD乳鼠，购自于凯学生物科技（上海）有限公司。Poly I：C（购自于上海玉博生物科技有限公司），TRIF、TLR3一抗（购自于上海研盟生物工程有限公司），pIRF3、NF-KB一抗（购自于上海沪震实业有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 于超净工作台取出生1d SD大鼠大脑皮质组织，在DMEM/F12青霉素小瓶中剪成1mm3的组织块，加入等体积的0.25%胰蛋白酶37℃消化5min，后加入含20%胎牛血清的完全培养液终止消化。液体采用200目滤网过滤，离心去上清，沉淀细胞接种于完全培养液中，在传代6次后即可使用。

1.2.2 实验分组和模型建立 分为对照组、氧糖剥夺组（OGD）、Poly I：C（10、20ug/ml）、预适应组（Poly I：C+OGD）。取第6代细胞按照分组分别采用DMEM或Poly I：C与DMEM孵育24h，对照组使用有糖培养基培养，其余各组采用无糖培养基培养。培养12h后进行指标检测。

1.2.3 Western blot检测TLR3、pIRF3、pNF-KB表达 在各组细胞中加入80ul的含有蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂的低温蛋白裂解液，4℃处理0.5h，12000r/min离心15min，取上清。配置含蛋白50ug电泳样品，制备厚度为1.0mm的5%聚丙烯酰胺凝胶（pH=6.8），8%分离胶（pH=8.8）。浓缩胶80V电泳0.5h，分离胶103V电泳至溴酚蓝燃料前沿至凝胶末端处。取出后4℃、横流电流250mA转膜2～3h，常温封闭90min，随后加入一抗，4℃过夜孵育，采用TBST洗膜后加入二抗常温孵育90min。加入ECL reagent显色液，暗室下胶片曝光、扫描后采用软件定量分析。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞TLR3蛋白表达影响

与对照组对比，OGD组和Poly I：C+OGD组星形胶质细胞TLR3表达水平增加（P＜0.01）；OGD组、Poly I：C+OGD各组之间互相对比星形胶质细胞TLR3表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），结果见图1。

图1 Western blot检测Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞TLR3蛋白表达影响

2.2 Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pIRF3蛋白表达影响

OGD组和Poly I：C+OGD组星形胶质细胞pIRF3表达水平均高于对照组（P＜0.05），Poly I：C+OGD组星形胶质细胞pIRF3表达水平均高于OGD组（P＜0.05），Poly I：C+OGD各组对比星形胶质细胞pIRF3表达水平无差异性（P＞0.05）。结果见图2。

图2 Western blot检测Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pIRF3蛋白表达影响

2.3 Poly I：C对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pNF-KB蛋白表达影响

OGD组和Poly I：C+OGD组星形胶质细胞pIRF3表达水平均高于对照组（P＜0.05），OGD组、Poly I：C+OGD各组之间互相对比星形胶质细胞TLR3表达水平无差异性（P＞0.05）。结果见图3。

图3 Western blot检测Poly I：C对对氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pNF-KB蛋白表达影响

3.讨论

大量研究证实，TLR3特异性受体激动剂Ploy I：C在缺血缺氧条件下对神经细胞存在保护作用。如Packard等[9]在小鼠闹缺血前给予Ploy I：C可有效缓解对神经细胞的损伤。宋璞等给予皮层神经元细胞Ploy I：C处理，结果表明Ploy I：C可有效缓解缺糖缺氧导致的原代神经细胞损伤。Borysiewicz等[10]采用H2O2处理建立缺糖缺氧星形胶质细胞缺氧模型，结果表明Ploy I：C可有效缓解H2O2导致的神经细胞损伤。

本研究结果表明，OGD组和Poly I：C+OGD组TLR3、pNF-KB表达水平均高于对照组（P＜0.05），pIRF3与对照组对比差异无统计学意义（P＞0.05）。Poly I：C+OGD组与OGD组对比，pIRF3蛋白表达水平增加（P＜0.05），pNF-KB表达水平降低（P＜0.05），TLR3表达无差异性（P＞0.05）。

综上所述，Poly I：C通过促进氧糖剥夺损伤星形胶质细胞pIRF蛋白的表达，进而上调下游抗炎因子干扰素-β的表达相关。