豇豆枯萎病拮抗木霉MA4菌株的分离与鉴定

申君 杨绍丽 吴仁锋

摘要：为筛选能有效抑制豇豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum）的生防真菌，采用平板稀释法和平板对峙法从武汉设施蔬菜根际土壤中分离、纯化、筛选出一株优势拮抗真菌MA4，根据形态学和菌株18S rDNA序列对MA4菌株进行鉴定，采用平板对峙法对其抑菌活性和稳定性进行测定，并进行盆栽防效试验。结果表明，MA4对豇豆枯萎病菌的抑制率为75.69%;根据其形态学鉴定和18S rDNA序列分析，确定MA4菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum），将该序列在GenBank中进行注册登录，登录号为MH539514。MA4菌株对番茄灰霉病菌、辣椒根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、茄子褐纹病菌、番茄早疫病菌、茄子烂秆病菌和番茄果腐病菌等8种病原菌均具有良好的抑制作用，抑制率为62.12%～86.93%;MA4菌株经10代继代培养后，对豇豆枯萎病菌的抑制率仍为80.86%。盆栽试验结果表明，接种14 d后施加MA4发酵液的处理病情指数为11.85%，防效达85.75%，且对豇豆植株具有一定促生作用。

关键词：豇豆枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum）; 分离与鉴定; 拮抗菌; 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）

中图分类号：S436.43         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）02-0079-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.018           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

豇豆[Vigna unguiculata （L.） Walp.]是一種世界性的豆科蔬菜，主要分布在温带、亚热带和热带地区[1]，在中国各地均有种植。豇豆枯萎病是由半知菌亚门真菌尖孢镰刀菌嗜导管专化型（Fusarium oxsyporum schl. f. sp. tracheiphlium，FOT）侵染引起的一种毁灭性土传病害[2]，在高温高湿条件下，可导致豇豆减产70%左右[3]。

目前，防治豇豆枯萎病主要是采用化学防治，但化学农药的长期大量使用导致生态环境破坏、次要病害猖獗、蔬菜农药残留超标等问题，直接影响了蔬菜的产量和品质[4]。因此，分布广、繁殖快、适应性强、抗菌谱广且能促进植物生长的生防真菌-木霉菌（Trichoderma spp.）成为当前研究热点之一。木霉菌是一种广谱的拮抗菌，至少对18个属中的29种植物病原菌具有拮抗作用，尤其对立枯丝核菌、镰刀菌、疫霉菌等引起的土传病害具有较好的防治效果[5]。近几年研究发现木霉菌在水稻枯萎病、香蕉枯萎病、草莓根腐病、玉米立枯丝核菌等土传病害上均有较好的抑制效果[5-9]，此外，木霉菌在黄瓜、苦瓜等蔬菜病害上有很好的防效，研究发现猥木霉（Trichoderma erinaceum）对黄瓜枯萎病菌的抑制率达到79.04%，盆栽防效高达87.5%[10];深绿木霉（Trichoderma atroviride）T52和平菇木霉（Trichoderma pleurotum）32080对黄瓜枯萎病菌的抑制率分别为86.3%和79.0%，其盆栽防效均超过60%[11];哈茨木霉菌对苦瓜叶斑病原菌链格孢属菌丝的生长具有抑制作用，其抑制率为70.4%～88.1%[12]。

目前，从设施蔬菜根际土壤中筛选豇豆枯萎病拮抗真菌的报道较少。本研究从武汉设施蔬菜根际土壤中筛选到一株对豇豆枯萎病菌具有较好防效的拮抗木霉菌MA4，对其进行鉴定，同时对其抑菌谱和稳定性进行测定，并进行盆栽试验验证其防效，以期为设施蔬菜的生物防治提供新的微生物资源。

1  材料与方法

1.1  材料

供试菌株：豇豆枯萎病菌、番茄果腐病菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子烂秆病菌（Phomopsis vexans）、茄子褐纹病菌（Phomopsis vexans）、辣椒根腐病菌（Fusorium oxysporum Schlecht）和黄瓜枯萎病菌（Fusorium oxysporum f. sp. cucumerinum）均由本实验室分离保存，番茄早疫病菌（Alternaria sonali）和西瓜枯萎病菌（Fusorium oxysporum f. sp. niveum）由长江大学农学院惠赠。

马丁氏培养基（MA）：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、K2HPO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、孟加拉红0.03 g、琼脂20 g、加去离子水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃高压灭菌30 min。使用时每毫升培养基中加入30 μg链霉素以抑制放线菌生长。

固体和液体马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g（液体PDA则不加）、去离子水1 L，pH 7.0，121 ℃高压灭菌30 min。

1.2  方法

1.2.1  样品采集与处理  供试9份根际土壤样品于2017年6月在黄陂区武湖基地黄瓜、番茄、辣椒、豇豆、芹菜和紫背天葵等设施蔬菜田块采集。样品自然风干，4 ℃保存备用。

1.2.2  真菌的分离  采用平板稀释法[13]：取土样5 g，加无菌水45 mL，置于全温培养摇床28 ℃振荡30 min，即为浓度10-1的土样，用无菌水依次稀释为10-2和10-3，每个浓度取100 μL涂布于马丁氏平板培养基上，28 ℃培养3～5 d，根据菌落的大小、形状等培养特征，挑取不同的单菌落于PDA培养基上进行分离纯化并编号，PDA斜面4 ℃保存。

1.2.3  拮抗菌的筛选  拮抗菌的初筛：参照起登风等[14]的方法，以豇豆枯萎病菌（FOT）为靶标菌，对分离到的真菌进行拮抗活性初筛。将FOT接种于PDA平板上培养5 d，用打孔器打成直径为5 mm的菌饼，接种于PDA平板中央，在距中央FOT 2.5 cm处对称接种4株上述分离纯化得到的菌株，使病原菌与分离的菌株呈十字交叉排列（病原菌在十字的中央，分离所得的菌株在十字的两端），以仅在中央接病原菌为对照，倒置于培养箱中，28 ℃培养5 d，记录病原菌半径，观察是否有拮抗活性。3次重复。

拮抗菌的复筛：采用平板对峙法[15]对上述获得的具有拮抗效果的真菌菌株进行复筛。将FOT和具有拮抗效果菌株同步进行活化5 d至菌落分布均匀，用打孔器打成直径5 mm的菌饼，分别将具有活性的菌株和病原菌同时接种在内径9 cm的PDA平板上，菌餅圆心相距约4.5 cm，连线经过平板圆心;以仅接病原菌为对照。接种后的平板倒置28 ℃培养箱培养7 d，测量病原菌对照菌落半径和病原菌菌落指向拮抗菌的半径。重复3次。按下面公式计算拮抗菌株对病原菌的抑菌率[16]。

1.2.4  拮抗菌株形态学鉴定  将待鉴定菌株接种到PDA平板上，置于28 ℃恒温培养，观察菌落形态和颜色，5 d后制作玻片在光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征。

1.2.5  拮抗菌株MA4 18S rDNA PCR扩增和序列分析  按OMEGA HP Fugal DNA Kit说明书提取基因组DNA，选用真菌18S rDNA通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′对菌株MA4进行PCR扩增。20 μL PCR反应体系：10 μmol/L的引物ITS1/ITS4各1 μL、I-5TM 2X High-Fidelity Master Mix 10 μL、DNA模板1 μL，补充ddH2O至20 μL。PCR反应程序：98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35个循环;72 ℃ 10 min;16 ℃ 10 min。PCR扩增产物直接送武汉擎科创新生物技术有限公司进行测序。将测得的基因序列在NCBI中通过BLAST程序与GenBank中核酸数据库进行对比分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），用MEGA6.0.6软件中的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树和聚类分析（Boot-strap=1 000），分析亲缘关系和系统发育。

1.2.6  拮抗菌株MA4抑菌谱测定  利用平板对峙法在PDA平板培养基上测定MA4菌株对番茄果腐病、茄子烂秆病、茄子褐纹病、辣椒根腐病、黄瓜枯萎病、草莓灰霉病、番茄早疫病和西瓜枯萎病等8种蔬菜病害病原菌的抑制作用。分别以仅接病原菌为对照，接种后的平板倒置于28 ℃培养箱培养7～10 d，测量病原菌对照菌落半径和病原菌落指向拮抗菌的半径。3次重复。

1.2.7  拮抗菌株MA4稳定性测定  在PDA培养基平板上对筛选到的MA4菌株连续进行10代继代培养，并每一代以FOT为指示菌，利用平板对峙法测定MA4菌株拮抗活性的稳定性。

1.2.8  拮抗菌株MA4盆栽防效测定  将种子用55 ℃温水浸泡30 min左右，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗干净根系，剪去根尖部分，浸入豇豆枯萎病菌孢子悬浮液（2.0×107 CFU/mL）中30 min，再移植到花盆中，置于大棚内培养。在接种病原菌7 d后做如下处理：①用MA4菌株发酵滤液灌根8 mL/株;②清水灌根8 mL/株为对照;再过7 d第1次统计病情指数，14 d第2次统计病情指数。在第1次病情统计结束后及时进行第2次灌根处理。

每处理3次重复，每重复10株。按时统计幼苗发病情况。计算病情指数和防治效果。

2  结果与分析

2.1  拮抗真菌的分离及拮抗效果

利用土壤稀释分离法从采集的9份土样中分离纯化得到真菌45株，分别将其命名为MA1～MA45。以FOT为靶标菌，采用十字交叉法筛选出10株对FOT具有抑菌活性的拮抗菌株。采用平板对峙法对10株拮抗菌株进行复筛，10个菌株对FOT的抑制率均超过50%，其中，MA4菌株抑菌效果最好（表1），对FOT的抑制率为75.67%，与其他菌株相比差异显著，且MA4菌株生长速度快，4 d左右长满培养皿，豇豆枯萎病菌基本停止生长。

2.2  拮抗真菌的鉴定

2.2.1  形态学鉴定  在PDA平板上，28 ℃培养，MA4菌株的菌落生长迅速，初期菌丝呈白色卷毛状，72 h菌丝基本长至培养皿边缘，继续培养，菌落颜色逐渐由浅绿色变为暗绿色，气生菌丝多，背面呈黄绿色。分生孢子梗主分枝稍微向顶端弯曲，主分支上有2～3个次级分支;瓶梗基部明显溢缩，顶部变细，在分生孢子梗尖端有2～5个涡状排列或单生且与主轴呈90°夹角;分生孢子椭圆形或近球形。参照上海交通大学木霉菌菌种保藏管理中心（http：//www.china-cctc.org）对哈茨木霉菌形态分类鉴定的描述，初步确定MA4菌株为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。

2.2.2  分子鉴定  利用真菌 TSl/ITS4对MA4菌株18S rDNA基因进行扩增，经序列分析得到666 bp的片段。将获得的序列与已在NCBI上登记的19种木霉菌的ITS序列进行比对，发现MA4菌株与哈茨木霉菌的相似性为99%，进一步证明MA4菌株为哈茨木霉菌，将该序列在GenBank中进行注册登录，登录号为MH539514。

2.3  拮抗菌株MA4菌株的抑菌谱

采用平板对峙法测定番茄灰霉病、辣椒根腐病、西瓜枯萎病、黄瓜枯萎病、茄子褐纹病、番茄早疫病等8种病原菌的抑制作用。结果（表3）表明，MA4菌株对8株供试病原菌具有不同的抑菌活性。其中对番茄灰霉病菌的抑制效果最好，抑制率为86.93%，与其他病原菌之间差异显著;对番茄果腐病菌的抑制效果相对较差，但抑制率也在60%以上。对其他6种病菌的抑制率均在70%以上。由此可见，MA4菌株抗菌谱较广，抑菌效果较好。

2.4  拮抗菌株MA4的稳定性

利用平板对峙法连续10代测定真菌MA4对FOT的抑制作用，结果如表4所示。拮抗真菌MA4对FOT的抑制率均超过75%，表明真菌MA4具有较稳定的拮抗活性。

2.5  拮抗菌株MA4盆栽防治效果

采用灌根接种法测定MA4菌株（7.20×107 CFU/mL）发酵滤液对豇豆枯萎病的防治效果。结果（表5）表明，接种7 d时对照组病情指数为41.00，MA4处理组病情指数仅为0.37，而14 d时对照组病情指数高达83.14，MA4处理组病情指数为11.85，MA4处理对豇豆枯萎病菌的防治效果為85.75%，且对豇豆植株有一定促生长作用。

3  小结与讨论

本研究从武汉设施蔬菜根际土壤中筛选出一株对豇豆枯萎病菌的抑制率达到75.69%的真菌菌株MA4，根据菌落形态、形态学观察和18S rDNA的ITS序列分析，确定该菌株为哈茨木霉，并将该序列在GenBank中进行注册登录，登录号为MH539514。哈茨木霉是目前木霉属中研究较多且潜力较大的生防菌，适应性好，生长范围广，可以通过竞争、重寄生、分泌抗生物质等途径对病原菌产生作用，对黄瓜灰霉病、白粉病、叶霉病、菌核病、霜霉病、玉米立枯病、香蕉枯萎病、苦瓜叶斑病、棉花枯萎病、棉花黄萎病、黄瓜枯萎病、小麦根腐病、草莓根腐病等均有显著防效[7-9，12，17-21]。

生防菌是植物病害防治的主要趋势，但在实际应用中存在活菌的存活率、定殖、繁殖能力、稳定性等问题，因此筛选出稳定性高、抑菌谱广的高效生防菌株对植物病害的防治具有重要意义[22]。本研究筛选出的哈茨木霉菌株MA4对豇豆枯萎病菌的抑制率达到75.69%，抑菌谱测定发现其对番茄灰霉病菌、辣椒根腐病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、茄子褐纹病菌、番茄早疫病菌、茄子烂秆病菌和番茄果腐病菌均有较好的拮抗作用，抑制率在62.12%～86.93%;且稳定性高，继代培养10代后，其对豇豆枯萎病菌的抑菌率仍有80.86%。盆栽试验表明，接种14 d后防治效果达85.75%，且对豇豆植株具有一定促生作用。由此可见，哈茨木霉菌株MA4是具有生防潜力的菌株，下一步将对其发酵条件和生防机理等进行研究，为研制绿色生物菌剂提供理论基础和依据。

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