柚皮苷对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞的逆转作用

崔美英，贺红柳，李 盼，毛 颖

(郑州大学第一附属医院病理科， 河南 郑州 450052)

肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率一直都位居全球首位。全世界每年肺癌的发病人数与死亡人数约为186万例和160万例[1]。在中国，男性肺癌的发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第1位，女性发病率占第2位，死亡率占第1位[2]。顺铂(cisplatin，cis-dichlorodiammine platinum，DDP) 是目前广泛采用且效果较好的治疗肺癌的化疗药物，但耐药性的产生是限制其疗效的主要原因[3]，因此逆转顺铂耐药性对延长肺癌患者的生存期十分有益。柚皮苷(naringin，NRG)是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎补、枳实、枳壳和化橘红等中药的主要有效成分之一。研究发现，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化和调节血糖等药理作用[4-8]。近年来的研究显示，柚皮苷可通过诱导凋亡、抑制增殖、阻碍侵袭和转移以及提高化疗药物敏感性而发挥抗肿瘤活性[9-11]。但关于柚皮苷对人肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP是否具有逆转作用尚未见报道。本实验旨在体外观察柚皮苷对人肺癌耐药株A549/DDP细胞的逆转作用，并探讨其可能的分子机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌细胞A549和顺铂耐药株A549/DDP购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。柚皮苷购自中国药品生物制品检定所；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640培养基购自HyClone；顺铂购自Sigma；CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、p-Akt、CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和β-actin单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Abcam。

2 方法

2.1细胞培养 人肺癌A549细胞和顺铂耐药株A549/DDP细胞用含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下培养。每2～3 d常规传代1次。为保持A549/DDP细胞的顺铂耐药性，每次换液时在细胞培养液中均添加顺铂(终浓度为1 mg/L)。

2.2CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期A549/DDP细胞，以每孔5 000个接种于96孔板，置于培养箱中孵育过夜,实验分成4组：(1)顺铂+A549细胞组：顺铂终浓度分别为2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、8 μmol/L和10 μmol/L；(2)顺铂+A549/DDP细胞组：顺铂终浓度分别为4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L和64 μmol/L；(3)柚皮苷+A549/DDP细胞组：柚皮苷终浓度分别为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L和160 μmol/L；(4)顺铂+柚皮苷+A549/DDP细胞组：顺铂和柚皮苷的梯度浓度分别与(2)、(3)组相同，二者联用的浓度比为1∶2.5；每个浓度设5个复孔，同时设无细胞调零组和无药对照组。继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培养1 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长吸光度A值，实验重复3次。按照下列公式计算药物对细胞活力的抑制率：抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。使用SPSS 16.0软件的Probit回归模型计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，并计算出耐药倍数，耐药倍数=DDP对耐药细胞的IC50/DDP对敏感细胞的IC50。

2.3药物联合效应的评价 采用Chou-Talalay中效分析法对药物联合效应进行评估。中效方程式为:fa/fu =(D/Dm)m，其中fa为抑制率，fu=1-fa，D为药物浓度，Dm为中效浓度，m为中效曲线斜率。两边取对数得lg(fa/fu)=mlgD-mlgDm，设Y=lg(fa/fu)，X=lgD, b=m，a=-mlgDm，得线性方程式：Y=a+bX。两药合用在不同效应的联合指数(combination index，CI)的计算公式为：CI=D1/DX1+D2/DX2，其中DX1和DX2为两药单用产生X效应时各自所需浓度，D1和D2为两药联用产生X效应时各自所需浓度，均可由中效方程式求得。应用CompuSyn 1.0软件绘制Fa-CI曲线，若CI<1，认为两药为协同作用，CI=1为相加作用，CI>1为拮抗作用。

2.4流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期A549/DDP细胞，分为无药对照(control)组、顺铂(DDP)组、柚皮苷(NRG)组及顺铂与柚皮苷联用(NRG+DDP)组，其中顺铂和柚皮苷的终浓度分别为16 μmol/L和40 μmol/L。置于培养箱中培养24 h后，收集各组细胞，PBS洗涤2次，先加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液，轻轻混匀，室温避光反应15 min，送流式细胞仪分析检测。

2.5Western blot法检测蛋白水平 裂解细胞提取总蛋白，用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，取25 μg蛋白样品进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭1 h，加入I 抗(抗P-gp、MRP1、p-Akt、CXCR4、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗体均以1∶1 000稀释，抗β-actin抗体以1∶2 000稀释)，于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入 II 抗(1∶1 000稀释)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL进行发光反应，暗室X胶片显影，拍照，使用ImageJ 1.45 s软件进行灰度分析。以目标蛋白与内参照β-actin灰度值的灰度比值作为目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件分析数据。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，Shapiro-Wilk法检验正态分布，Levene法检验方差齐性。细胞抑制率、流式细胞术和Western blot检测数据均符合正态分布且方差齐性，故采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 顺铂耐药前后A549细胞中相关蛋白表达的变化

我们采用Western blot法检测了顺铂耐药相关蛋白的表达,结果发现与非顺铂耐药株A549细胞相比，顺铂耐药株A549/DDP细胞中的P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平均显著上调(P<0.05)，表明A549细胞顺铂耐药性的产生可能与上述蛋白的高表达密切相关，见图1。

Figure 1.The protein expression of P-gp, MRP1, p-Akt and CXCR4 in A549 and A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549 cells.

图1A549和A549/DDP细胞中P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白的表达

2 柚皮苷和顺铂对A549/DDP细胞活力的影响

与0 μmol/L组相比，2～10 μmol/L DDP组的A549细胞活力均明显降低(P<0.05)，IC50为6.37 μmol/L，见图2。A549/DDP细胞经顺铂和柚皮苷单独处理24 h后，细胞活力受到显著抑制，且呈剂量依赖性(P<0.05)，IC50分别为36.92 μmol/L和129.77 μmol/L；与DDP单独用药组相比，当2种药物按1∶2.5联合作用时，对细胞活力的抑制作用显著强于相同浓度的顺铂处理组(P<0.05)，见图3。药物联合作用24 h的IC50为57.72 μmol/L，其中顺铂和柚皮苷的浓度分别为16.49 μmol/L和41.23 μmol/L。这表明柚皮苷与顺铂单独或联合作用对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP均具有毒性作用，且二者联用效应更强。

3 柚皮苷和顺铂联合应用评价

依据上述CCK-8法结果，采用CompuSyn 1.0软件计算得出Fa-CI曲线，当Fa<0.15时，CI>1，柚皮苷和顺铂联用呈拮抗效应；当Fa>0.15时，CI<1，两药合用产生协同效应，见图4。

Figure 2.The effect of DDP on the viability of the A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

图2DDP对A549细胞活力的影响

4 柚皮苷和顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，顺铂组、柚皮苷组以及柚皮苷与顺铂联用组的细胞凋亡率均显著升高(P<0.05)，其中顺铂和柚皮苷的终浓度分别为16 μmol/L和40 μmol/L；此外，柚皮苷与顺铂联用组的细胞凋亡率显著高于顺铂组(P<0.05),提示柚皮苷可协同增强顺铂诱导的A549/DDP细胞凋亡，见图5。

Figure 3.The inhibitory effect of NRG and/or DDP on the viability of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDDP group.

图3柚皮苷与顺铂单独或联合抑制A549/DDP细胞活力

Figure 4.The graph of combination index (CI) and fraction affected (Fa).

图4药物联合指数(CI)与抑制率(Fa)曲线图

Figure 5.The effects of NRG and DDP on the apoptosis of A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDDP group.

图5柚皮苷和顺铂对A549/DDP细胞凋亡的影响

5 柚皮苷与顺铂对Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的影响

Western blot法检测结果显示，与对照组相比，顺铂组、柚皮苷组以及柚皮苷与顺铂联用组的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平上调(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平下调(P<0.05)；与顺铂组相比，柚皮苷与顺铂联用组的Bax和cleaved caspase-3蛋白水平明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05),提示柚皮苷协同增强顺铂诱导A549/DDP细胞凋亡可能与Bcl-2/Bax比率下调有关，见图6。

Figure 6.The effects of NRG and DDP on the protein levels of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDDP group.

图6柚皮苷和顺铂对Bcl-2、Bax和cleavedcaspase-3蛋白水平的影响

6 柚皮苷对P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平的影响

Western blot法的检测结果显示，经不同浓度柚皮苷处理24 h后，A549/DDP细胞中的P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平明显下调，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见图7。

讨 论

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,由于大多数患者确诊时已发展至晚期，失去了手术治疗机会，因此化疗成为治疗肺癌的主要手段。顺铂是临床治疗肺癌常用的一线化疗药物，多数患者在化疗初期对顺铂敏感，但随后产生的耐药性限制了顺铂的临床应用。顺铂耐药性的产生涉及多种机制，其中膜转运蛋白介导的药物外排是导致顺铂耐药的重要机制之一，如P-gp和MRP1等过度表达可降低药物对肺癌细胞的毒性作用[12]。此外，肺癌细胞还可通过提高抗凋亡能力降低对顺铂的敏感性[13]。在本研究中，顺铂对A549细胞和A549/DDP细胞的IC50分别为6.37 μmol/L和36.92 μmol/L，耐药株A549/DDP细胞的耐药倍数为5.80;Western blot法检测也证实顺铂耐药相关蛋白P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4在顺铂耐药株A549/DDP细胞中呈高表达。

Figure 7.The effects of NRG on the protein levels of P-gp, MRP1, p-Akt and CXCR4 in the A549/DDP cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs20 μmol/L group;△P<0.05vs40 μmol/L group.

图7柚皮苷对P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平的影响

近年来，多项人体研究发现柚皮苷是一种安全高效的P-gp抑制剂，并对药物代谢动力产生影响[14-16]，提示柚皮苷在逆转肿瘤多药耐药方面潜力较大。Zhu等[11]研究证实，柚皮苷可通过下调P-gp蛋白逆转人卵巢癌SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药性。但目前对于柚皮苷对人肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的逆转作用尚未见报道。在本研中，我们采用CCK-8法检测了柚皮苷与顺铂对人肺癌顺铂耐药株A549/DDP细胞的毒性作用，结果表明，柚皮苷与顺铂均可显著抑制A549/DDP细胞活力且具有剂量依赖性，两药联用则对细胞活力的抑制作用更加显著。进一步采用Chou-Talalay中效分析法对两药的联合效应进行评价后发现，当抑制率超过15%时，两药联用可产生协同效应。与之相一致，流式细胞术检测结果也表明，柚皮苷可增强顺铂诱导的细胞凋亡。上述结果表明，柚皮苷可逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。

为初步探究柚皮苷与顺铂协同诱导A549/DDP细胞凋亡的分子机制，我们采用Western blot法检测了Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及p-Akt蛋白水平的变化。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白，而Bax为促凋亡蛋白。当Bcl-2表达上调和/或Bax表达下调时，顺铂的促凋亡作用可被显著抑制[17-18]。Zhang等[19]研究证实，使用PI3K/Akt通路抑制剂wortmannin可诱导A549/DDP细胞凋亡，并逆转其顺铂耐药性。本研究结果显示，柚皮苷和顺铂单独作用均可显著下调Bcl-2蛋白水平、上调Bax和cleaved caspase-3蛋白水平，两药联用可协同增强对Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白水平的调控。同时柚皮苷还可剂量依赖性地下调p-Akt蛋白水平。这初步揭示了柚皮苷增强顺铂诱导A549/DDP细胞凋亡的分子机制。

CXCR4是G蛋白偶联的7次跨膜受体。研究发现CXCR4在多种恶性肿瘤的生长、侵袭和转移过程中发挥着重要作用[20-23]。近年来多项研究证实，CXCR4与多种肿瘤的顺铂耐药性的产生密切相关[24-25]。Xie等[26]研究发现，CXCR4在顺铂耐药患者的肺癌组织中的表达明显高于其在顺铂敏感患者的肺癌组织中的表达，同时还发现在体外沉默CXCR4基因表达可逆转A549/DDP细胞的顺铂耐药性。在本研究中，柚皮苷可剂量依赖性地下调CXCR4蛋白水平。由此推测，这可能是柚皮苷逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性的机制之一。

P-gp和MRP1同为ATP结合盒式转运蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC transporters)超家族成员，这类蛋白质能够结合ATP 并利用能量将细胞内药物转运至胞外。Zheng等[27]采用改良的纳米颗粒将P-gp的siRNA导入A549/DDP细胞后，可显著提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。采用RNA干扰技术沉默MRP1基因表达也同样可以增强顺铂对A549/DDP细胞的毒性作用[28]。本研究证实，柚皮苷可剂量依赖性地下调P-gp和MRP1的蛋白水平,这将有助于减少顺铂的外排，从而提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

综上所述，柚皮苷可协同增强人肺癌耐药株A549/DDP细胞对顺铂的敏感性，这可能与柚皮苷上调Bax蛋白水平，下调P-gp、MRP1、p-Akt和CXCR4蛋白水平，进而促进凋亡和减少顺铂外排有关。本研究为柚皮苷改善肺癌治疗现状提供了一定的证据支持。