环状RNA在实体肿瘤中的研究进展*

姚立帅， 王慧芳， 郑燕芳， 陈群清

南方医科大学珠江医院 1胸心外科， 3肿瘤中心(广东广州 510280)； 2广东省人民医院重症医学科 (广东广州 510080)

环状RNA(circular RNAs,circRNA)因其呈环状而得名，是一类种类繁多的非编码RNA。它广泛且稳定地存在于生物界，是一种比线性mRNA含量更为丰富的转录本，能够通过多种分子在细胞各个阶段起调控作用，并与心血管系统疾病、神经系统退行性疾病、肿瘤等多种危害人类健康的疾病相关。本文将对circRNA在实体肿瘤中的研究进展作以下综述。

1 circRNA的历史及特点

1.1 circRNA的研究历史 30多年前，Sanger等[1]首先通过电子显微镜在植物病毒中发现真核RNAs可以以环状形式存在，随后Kos等[2]在丁型肝炎病毒中同样发现circRNA存在。接着研究者在人类的E-Twenty-Six-1基因(Ets-1)[3]和小鼠的Sry基因[4]中鉴定出内源性circRNA是由既往已知信使核糖核酸(mRNA)加工合成的，尤其侧翼序列中反向序列的存在是小鼠Sry基因循环的关键[5]，特别是在较长的外显循环更为显著[6]。来自反向剪接外显子的大多数circRNA是稳定的，并大多存在于细胞质中[7]，这是由于它们对细胞线性RNA衰变机制存在抗性。然而，与线性RNA相比，circRNA的转录表达水平较低[8]。生物信息学分析显示，反向剪接的外显子通常侧接较长的内含子，并且侧翼内含子中非自主的逆转录转座子(Alu元件)的存在被计算预测与人circRNA的形成高度相关[7]。在哺乳动物中，已经鉴定了由蛋白质编码基因的外显子产生的circRNA，并作为调节性“miRNA海绵”起作用[9]，其在心血管疾病、朊病毒、神经退行性疾病以及肿瘤中也不断被验证发挥着巨大的作用。

1.2 circRNA主要特点 circRNA分子种类繁多，数目庞大，且分布广泛，从真核、原核生物到病毒，从果蝇到人类，从细胞质、细胞核到人类分泌物都能发现大量circRNA，circRNA的表达在各物种之间高度保守[7-10]，但是在同一种族的各细胞之间却具有特异性，同时细胞中的circRNA会随着细胞周期进程发生变化；细胞质中的circRNA占大多数，并主要为外显子来源，内含子来源以及外显子内含子共同组成的circRNA主要存在于细胞核内[8]；circRNA由于缺乏易被降解的poly尾端以及通过RNA折叠使其具有高稳定性[7, 11]。正常情况下其半衰期一般超过48 h，但是由于存在对RNA内切酶的抵抗使在血清中只有15 s，此外由于缺乏RNA套索特征结构的2-5链使其对RNA脱支酶也同样具有抵抗力；circRNA比相关的线性mRNA更稳定[7]。

1.3 circRNA形成机制 circRNA由特殊的前体mRNA经各种可变剪接产生，主要包括3种：(1) 经套索驱动环化和内含子配对驱动环化形成的外显子来源circRNA，前者由外显子组成的剪接供体和剪接受体共价结合后切除内含子而形成circRNA，后者由两个内含子通过碱基互补配对形成环状结构后切除内含子而形成 circRNA；(2)内含子通过形成索套结构后发生部分降解而产生的内含子来源circRNA；(3)在剪接过程中外显子发生环化并同时保留了内含子的外显子和内含子共同组成的circRNA[8, 10, 12]。而产生circRNA的一种特殊的方式是通过“反向剪接”，其中剪接供体与上游剪接受体结合而不是正常剪接反应中与下游受体结合。这导致外显子跳过并产生含有被跳过的外显子的circRNA。反向剪接发生频率很低，但当剪接供体和受体通过RNA二级结构或蛋白结合在一起时可以促进反向剪接[12]。

2 分子生物学功能

2.1 miRNA海绵 “miRNA海绵”机制是目前研究比较透彻的机制，该机制提出一些circRNA上具有特定miRNA的靶点位，可以特异性地结合miRNA，以提高相应mRNA的胞内浓度，调节细胞功能[9]，在肿瘤中常常表现为肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变，目前研究比较多的是CiRS-7[13-14]，这是一种带有大量miR-7结合位点的circRNA，主要和脑发育相关，并通过此途径调节CDRlas，进而影响神经系统。在提出基因海绵机制之后，便出现了环状miRNA海绵是否是普遍的现象这样的问题，继而引发探索性试验，研究员通过预测，找到了睾丸特异性Sry RNA中有16个推测的miRNA靶位点，通过一系列敲低和过表达等试验证明了环状Sry RNA可以作为miR-138海绵的结论,继而得到环状miRNA海绵是一种比较普遍的功能[13]。

第三军医大学西南医院肝胆外科研究所根据既往基因海绵机制，结合已知的外泌体作用特点(外泌体是一种具有脂质双分子结构的纳米级小泡[15-16]，由多种细胞主动分泌[17]，小泡内含有蛋白质、脂质、miRNAs、lncRNAs和circRNAs[18]，肿瘤细胞可以在发生发展过程中不断释放外泌体[19]，影响细胞通讯，并且调节肿瘤微环境，促进增殖和迁移[20]，外泌体广泛分布于体液中，可被其他细胞所吸收[21-23])，敏锐察觉出血浆中外泌体中非编码circRNA异常，极有可能和肿瘤有关，通过实验进一步证明了，胰腺癌细胞产生大量circ-IARS，并通过外泌体方式排出细胞，被内皮细胞吸收，通过基因海绵的作用机制结合内皮细胞的miR-122,抑制其表达，减轻其对靶基因小G蛋白超家族的亚家族成员RhoA的抑制，减少了ZO-1和肌动蛋白的表达，从而改变了内皮细胞的通透性，此过程影响了肿瘤细胞的侵袭和转移，极有可能成为胰腺癌早期诊断和预后检测的重要指标，此思路也指导我们要从更多路径去考虑、探索基因海绵的作用机制[24]。

2.2 调节RNA结合蛋白 随着研究的深入，相关试验的数据有力地证明了circRNA是经转录来的。circRNA通常由剪接体产生，剪接体进一步涉及到circRNA的生产。因为环状结构非常依赖于包围外显子的规范的剪接位点，因此,侧翼外显子的线性剪接可以与circRNA相竞争。这些竞争效应是非常强的，甚至可以将circRNA水平降低一个数量级。侧翼内含子序列是确定给定外显子的环化效率的主要因素。与相似内含子长度的对照基因相比，携带circRNA的基因的剪接效率较低。试验数据表明线性拼接和circRNA生产可以相互调节并竞争剪接位点。事实上，大多数circRNA的主要影响的是对宿主mRNA的线性剪接。研究员的试验数据也证明了RNA拼接蛋白(MBL)在circMbl生物合成中发挥直接作用，circMbl侧翼的内含子具有许多MBL结合位点，这对于依赖于MBL水平的外显子的环化是必需的。当蛋白质过量时，其通过促进circMbl产生而降低其自身mRNA的产生，然后circRNA可以绑定多余的MBL蛋白。剪接因子可以通过抑制或增强循环外显子上游的基因内区的剪接来实现circRNA生物发生和规范剪接之间的平衡[25]。

2.3 宿主基因转录率 研究员在相关研究中发现了一类与人类细胞中的RNA聚合酶Ⅱ相关联的circRNA。在这些circRNA中，外显子与保留在外显子之间的内含子环化;我们称它们为外显子-内含子circRNA或EIciRNA(exon-intron circRNA)。EIciRNAs主要定位在细胞核中，与U1小核RNA (U1 snRNP)相互作用并促进其亲本基因的转录。研究结果揭示circRNA可以调节细胞核中的基因表达，其中EIciRNAs可以增强基因顺式表达，并通过特定RNA-RNA相互作用达到目的。EIciRNAs可以通过U1 snRNA和EIciRNA之间的RNA-RNA相互作用产生复合物，然后EIciRNA-U1 snRNP复合物可以进一步与Pol Ⅱ转录复合物启动子相互作用，增强亲本基因表达。一旦基因的转录开启，EIciRNA从基因的生成将进一步促进基因的转录，从而产生积极的反馈。U1 snRNA的常规功能是剪接，但额外的证据表明U1 snRNP具有其他作用，如刺激早期转录事件，防止过早的聚腺苷酸化和确定启动子方向。ncRNA之间的特异性RNA-RNA相互作用，例如U1 snRNA和EIciRNA之间的相互作用是ncRNAs的功能机制的核心[26]。

2.4 翻译 circRNA缺乏帽子结构以及poly尾，两个特征是线性mRNA有效翻译所必须的[27]。帽子结构被真核起始因子识别，使得其可以扫描带有起始密码子的mRNA。在既往文献中提到，circRNA翻译必须有核糖体的替代机制存在，即内部核糖体进入位点(IRES)元件，其直接结合起始因子或核糖体本身，这种方法被多种病毒使用以确保它们自己的翻译以不依赖帽子结构的方式发生， Sarnow实验室在1995年的开创性工作表明，脑心肌炎病毒(EMCV)IRES可以在体外驱动人工circRNA的翻译[27-28]。大量实验提供了circRNA翻译的证据：(1)circRNA与翻译核糖体的特异性结合；(2)产生来自circRNA小基因的蛋白质；(3)发现在circMbl中支持终止密码子的RFP读数；(4)存在能够促进几个circRNA上的帽独立翻译的序列；(5)发现肽匹配circbl3，但没有已知的线性同种型；(6)通过western印迹检测推定的circMbl编码的蛋白质;(7)测定生理因素可以调节这些蛋白质的水平。并且在实验中发现circRNA翻译的一些特点：在热休克条件下增加，提示了 circRNA编码的蛋白质可能在应激反应中发挥作用。通过IRES的不依赖于帽子结构的翻译在癌症中增加以促进其应激反应，并在增殖、凋亡和细胞周期调节中起重要作用，因为circRNA只能通过帽独立翻译来完成翻译过程，我们推测来自circRNA的翻译可能在癌细胞中更普遍[29-30]。

2.5 复杂串扰功能 circRNA可以作为ceRNA，即miRNA海绵发挥作用，从而吸附相关的miRNA。一旦circRNA通过急性治疗(例如，用siRNA，shRNA，ASO或LNA GapmeR)，其所连接的miRNA被释放并游离以结合和抑制ceRNA。作为急性干预的最终结果，ceRNA被下调[31]。在不同的情况下，由于慢性治疗或敲除，长期缺乏circRNA海绵导致其结合miRNA转录后机制出现不稳定。因此，其他ceRNA靶向性下降并且表达增加[32]。

3 在疾病中的生物学作用

3.1 肝癌 在研究中发现Twist1可以通过circ-10720吸附miRNA介导的间接途径调节波形蛋白的表达。敲低circ-10720之后减弱了Twist1对肝癌细胞波形蛋白表达的影响。在PDX和DEN诱导的TetOn-Twist小鼠HCC模型中，通过肿瘤内或静脉内注射用si-circ-10720处理小鼠，结果显示，沉默circ-10720阻断了Twist1对波形蛋白表达和促进HCC恶性和转移的作用。这些结果证明了Twist1对波形蛋白的间接调控机制，并指出了circRNA在EMT中的重要作用。并通过病理分析HCC组织标本证明了，circ-10720与不良预后和肿瘤进展相关，circ-10720可能成为HCC的潜在生物标志物[33]。

3.2 胶质瘤 该研究通过胶质瘤与配对的正常脑组织比较，发现了Notch信号通路在肿瘤组织中显著上调。确定了circNFIX可能充当了miR-34a-5p的海绵，miR-34a-5p是一种靶向NOTCH1的miRNA。circNFIX的下调和miR-34a-5p的上调均抑制细胞增殖和迁移。而且，在体内证明si-circNFIX可以通过调控miR-34a-5p通过靶向Notch信号通路抑制胶质瘤生长[34]。

3.3 乳腺癌

3.3.1 circ-Dnmt1与乳腺癌 最新研究发现circ-Dnmt1在人乳腺癌细胞中显著高表达。circ-Dnmt1的表达不仅增加了细胞增殖和存活，但也刺激细胞自噬，抑制细胞衰老和增加肿瘤生长。这些效应可以通过直接与p53和Auf1结合，并促进它们的核转位来调节。据我们所知，细胞质p53抑制自噬，而核p53可以增强自噬，p53和Auf1的核转位将诱导细胞自噬和Dnmt1表达增加，并且抑制了p53转录。结果显示，circ-Dnmt1的表达增加导致了p53转录的抑制，这是circ-Dnmt1在增强细胞自噬、减少细胞衰老和促进细胞增殖、存活和肿瘤生长中的主要作用方式[35]。

3.3.2 circ-Ccnb1与乳腺癌 据以往研究我们得知了突变型p53不能结合H2AX。Bclaf1是一种H2AX依赖性的肿瘤抑制因子，最新研究发现在p53突变细胞中，circ-Ccnb1与H2AX和Bclaf1形成复合物，可以促进癌细胞死亡。这个过程只发生在p53突变细胞中，因为在野生型p53细胞中，野生型p53具有更强的结合H2AX的能力，从而使Bclaf1与Bcl2结合，Bclaf1与Bcl2的结合将促进细胞增殖。这种结合在突变型p53存在时被破坏，其中Bclaf1可以与H2AX和circ-Ccnb1相互作用，诱导p53突变型癌细胞死亡[34]。

研究结果证实了circ-Ccnb1对p53野生型细胞没有影响，因为它实际上可以增强p53野生型细胞的增殖和存活。正是基于这一点，这种潜在的药剂将大大降低对使用这种方法进行癌症治疗的患者的周围基质组织和健康细胞的影响，将是一种效果显著但是不良反应极小的良药。

3.4 膀胱癌 相关研究发现circ-ITCH在BCa组织和细胞系中均下调。BCa患者的circ-ITCH表达水平低，生存期会出现相应缩短。体外/内的实验同样证明，circ-ITCH可以抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。并最终证明了circ-ITCH通过海绵化miR-17和miR-224，上调了miR-17和miR-224靶基因p21和PTEN的表达，从而抑制BCa的侵袭性[36]。

3.5 肺癌新型液体活检生物标志物 血浆F-circEA的检测是一种监测EML4-ALK易位患者的特异性较高且比较方便的方法，可以指导EML4-ALK靶向的NSCLC治疗，F-circEA、EML4-ALK线性转录物和融合蛋白不同，其可以促进细胞迁移和侵袭，从而有助于肿瘤发展。这些结果增加了EML4-ALK融合基因对肿瘤发生的调节。值得注意的是，F-circEA特异性存在于EML4-ALK阳性NSCLC患者的血浆中的证据表明F-circEA可以是一种新型“液体活检”生物标志物，用于监测NSCLC中的EML4-ALK融合基因[37]。

4 展望

针对circRNA的研究越来越多，从最初的无效的基因剪接到存在复杂的生理过程，circRNA发挥不可替代的调节功能。circRNA成为众多疾病潜在诊断和治疗靶点，从最初的基因海绵(从心脑血管疾病几乎扩展到全身各种疾病)、结合蛋白、影响基因转录到发现可以翻译、通过外泌体影响正常细胞等。尽管我们通过疾病发现某些基因的异常表达，但是其在正常细胞中是如何发挥作用的我们还不得而知。因此，我们能否通过血液中的circRNA表达差异发现疾病，通过药物控制血液中的circRNA达到控制疾病和治疗疾病的目的，又能否通过局部治疗改变局部circRNA的浓度以达到改变疾病进程的目的，这些都是我们的研究目标。同时我们也必须要认清现实，我们所探究的circRNA还只是冰山一角，随着科技和研究手段的发展和进步，必定有更加重要的功能被发现，在疾病的预防、诊断和治疗中发挥更大的作用。