冷冻卵巢移植研究进展

王生存，李碧春

肿瘤诊断和治疗的进步改善了疾病的预后，使患者的生存率大大提高。然而，化疗或放疗可能会导致卵巢早衰，危害患者的生育力。此外，肿瘤的发病呈年轻化趋势，女性患者保留生育力的需求亦逐渐增加。卵巢组织冷冻保存和移植是即将接受癌症放化疗治疗的女性保存生育力最主要和最可行的选择[1]。特别是一些儿童患者没有成熟卵泡可保存，更无法冻存胚胎，最可行的方案是卵巢组织的冷冻保存，该方法可储存大量的原始卵泡和初级卵泡并且能够确保卵巢内分泌功能的恢复[2]。然而，卵巢组织移植仍然存在很多挑战，比如怎样在冷冻和移植过程中减小卵泡的损伤和丢失。

半个多世纪前，一项关于小鼠的研究首次报道了经过冷冻保存的整个卵巢组织原位移植后成功生育[3]。2004年Donnez等[4]报道了第一例人类利用卵巢组织冷冻保存和移植获得的活产儿，这是人类生殖医学史上的一个里程碑。研究人员也一直在寻找恢复人类、非人类灵长目动物、家养动物[5]或实验动物[6]生育力的最佳方法。

卵巢的自然可塑性有利于其移植到不同的部位，因为其含有天然丰富的血管生成因子，有利于新血管形成，使血管重建并迅速恢复正常生理功能。卵巢组织可以被原位移植到盆腔或异位移植到皮下区域、肾被膜、脂肪垫以及其他部位[7]。根据移植部位的不同，可分为原位移植和异位移植；根据移植受体的不同，可分为异种移植、同种异体移植和自体移植。

1 卵巢组织移植部位

1.1 原位移植 原位移植即组织移植到其起源位置或者盆腔。在这种类型的移植中，组织被重新植入其原始生理环境中。卵巢组织原位移植的主要优点是不需要辅助生殖技术的干预就可以自然妊娠。Donnez等[8]报道，与异位移植相比，盆腔可为卵泡发育提供最佳的环境，这是因为盆腔的温度、压力、旁分泌因素和血液供应与卵巢正常生理状况下相似。其缺点是由于受体残存卵巢或卵巢窝发生萎缩，容积变小，可容受的卵巢组织体积受限；另外，原位移植是一种侵入性操作，可能导致严重的盆腔粘连。

在动物生产中，第一个令人鼓舞的结果是由Gosden等[9]于1994年在绵羊中获得的，报道了通过慢速冷冻保存的卵巢组织在原位自体移植后恢复发情周期、成功妊娠并获得活产。随后，Salle等[10]和Bordes等[11]也报道了使用玻璃化冷冻的卵巢原位移植在母羊获得活产。此外，Santos等[12]研究证明在没有激素的补充下，经冷冻和原位自体移植的小的卵巢切片在双侧卵巢切除的山羊体内可以完成卵泡发育并恢复内分泌功能。

目前有两种方法成功地用于新鲜或冷冻复苏后的卵巢组织原位移植：在腹膜开一个特殊的小窗或在残余的卵巢上开一个特殊的窗口。卵巢的大块组织（8 mm×5 mm～10 mm×5 mm）可以在去除天然皮质后缝合到残余的卵巢中。然而，由于无法缝合，在髓质空间移植小块组织（2 mm×2 mm）十分困难。此外，Silber等[13]报道在8例同卵双胞胎之间原位移植新鲜和冷冻保存的卵巢组织，77～142 d后月经周期和血清卵泡刺激素（FSH）水平恢复正常，其中6例患者自然受孕7次，已获得3例活产。Burmeister等[14]也报道了澳大利亚第一例人类卵巢组织冷冻保存和原位自体移植成功妊娠，这是乳腺癌患者化疗后移植卵巢保存生育力的成功案例。

1.2 异位移植 异位移植是在组织冷冻保存过程之后移植到不同的部位或者卵巢外部其他区域，比如腹壁、前臂、肾被膜或者乳房等部位。异位移植的潜在优点包括：避免侵入性操作；容易接近移植物；增加皮质切片的体积；即使因严重的盆腔粘连不能进行原位移植，异位移植也是可行的。另外，异位移植不需要全身麻醉，而且动物实验中移植块的去除相对容易。然而，与原位移植不同，卵巢组织异位移植主要是为了维持机体正常激素水平以及保存卵细胞，受孕需要体外受精。

卵巢组织可以移植在皮下区域和肾囊等各种囊腔，这些部位血液供应良好能够提高移植物的存活率[7]，最常用的移植部位是肾被膜。与小鼠的皮下区域相比，肾囊处的移植成功率和卵母细胞产率显著提高[7]。无论移植部位如何，移植后到血管重建前这个阶段，卵巢移植物可能发生缺血和潜在的卵泡闭锁，这个过程对该技术的成功仍然是一个挑战。然而，由于代谢速率低，原始卵泡对缺氧有一定的耐受力[15]。

目前，人类和其他灵长目动物的卵巢异位移植经验非常有限。已经在人类中测试了几个异位部位，包括子宫阔韧带、腹直肌、前臂、乳房组织、腹部皮下组织和腹膜下组织。在灵长目动物的研究中，也使用了其他异位部位（网膜、腹膜后髂窝、子宫浆膜、输卵管系膜和骨盆壁）。除了腹膜内或腹膜下外，腹部的皮下组织也可以为人类和灵长目动物的卵泡生长提供适当的环境[12]。然而，与腹腔环境相比，由于温度、旁分泌因素和血液供应的不同，异位部位也许不能提供卵泡发育的最佳环境。灵长目动物模型已经被用于寻找合适的移植部位来克服这些挑战[16]。人类冷冻保存的青春期前卵巢组织的异位异种移植后卵泡存活率高，是由于移植物中保留有大量的休眠原始卵泡。此外，Stern等[17]首次报道双侧卵巢切除术后妇女冷冻保存的卵巢组织异位移植后获得临床妊娠。因此，移植部位的选择是未来移植卵巢存活和卵母细胞活力的一个重要决定因素。

2 卵巢组织的移植受体

2.1 异种移植 免疫缺陷小鼠已被用来评估卵巢组织冷冻保存后的卵泡发育和生存潜能。一些研究表明，将人卵巢组织异种移植到小鼠体内已经成为研究体内卵巢功能和卵泡发育的有效模型。自1960年以来，裸鼠已经成为建立人类恶性肿瘤体内模型的标准。由于缺少胸腺，裸鼠不能产生成熟的T淋巴细胞，因此不能产生大多数类型的免疫应答[18]。这种T细胞功能的缺失不仅防止裸鼠排斥同种异体移植物，甚至防止其排斥异种移植物[18]。另一个模型是使用重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠[18]。SCID小鼠是卵巢异种移植第一个也是最常用的模型，其特征是scid突变，导致抗原受体基因重组缺陷，削弱了产生B/T淋巴细胞的能力。SCID小鼠可以维持异种组织的存活，而不会表现出移植物抗宿主反应，因此其可以作为移植研究的良好模型。在SCID小鼠产生几年后，有学者将scid突变转移到非肥胖糖尿病（NOD）上，形成NOD-SCID小鼠，其除了B/T淋巴细胞缺陷外，还降低了自然杀伤（NK）细胞的活性。此外，NOD-SCID小鼠激活补体系统某些组分功能受损，并且显著缺乏巨噬细胞。

为了建立人卵巢基质皮下移植小鼠模型的新方案，将正常人卵巢组织皮下植入SCID小鼠中，然后通过免疫组织化学鉴定植入物。结果表明人卵巢组织在SCID小鼠宿主中成功存活并保留了原始正常卵巢组织的性质[19]。Luyckx等[20]曾报道，冻融青春期前患者的腔前卵泡可以在长期卵巢异种移植后成功存活和发育。Henry等[21]将绵羊卵巢异种移植到SCID和NOD-SCID小鼠后的研究表明，它们都适用于移植物恢复的研究，但是根据组织学分析，SCID小鼠的卵巢整体组织形态保持得更好。在将大鼠卵巢异种移植到免疫缺陷小鼠的肾囊中后，卵巢代谢和功能相关基因表达水平显著改变。Ishijima等[22]研究也证明在免疫缺陷小鼠异种移植犬冻存卵巢后卵泡丢失比例较高。此外，已经证明在SCID小鼠异种移植过程中，用血管内皮生长因子165（VEGF165）在胶原基质中包裹卵巢组织使得功能性血管形成和早期血运重建更快[21]。Lotz等[23]报道1例6岁女孩的卵巢切片异种移植122 d后，在没有外源性激素刺激的情况下形成窦状卵泡。此外，研究表明分离的人类卵泡被封装后能够在纤维蛋白凝块和短期异种移植中生存[24]。

2.2 自体移植或同种异体移植 如前所述，临床上人类卵巢组织移植的主要目标是恢复接受放化疗妇女的生育力和内分泌功能。目前，至少有10个国家的研究小组已经证明，冻存卵巢组织移植是保留女性癌症患者生育力的潜在选择[25]。卵巢组织冷冻保存允许立即开始癌症治疗，与其他技术（例如胚胎或卵母细胞冷冻保存）相比，其不需要预先卵巢刺激和精子捐献。

因为有些研究不直接参与临床，其主要焦点是动物生产的生物技术，所以很难统计所有科研实验或临床实践中卵巢组织的确切移植次数。Donnez等[8]也提出，世界范围内进行的卵巢组织移植手术数量尚不可知。然而，在美国、比利时、法国、西班牙、丹麦和以色列等国家都有成功的案例。此外，日本、意大利、德国和澳大利亚的研究小组也报道了成功案例[26]。应用该策略除了可以获得良好的卵巢功能恢复率（95%）和一定的妊娠率（23%）之外，卵巢功能持续时间约为4～5年[27]。

自体移植卵巢组织只有在移植物中没有癌细胞的情况下才可以进行，并且在进行卵巢移植时对恶性细胞的复种应该有所警惕。卵巢组织冷冻保存和自体移植的缺点包括卵巢移植物的寿命有限，这是由于潜在的移植后缺血引起的卵泡闭锁。此外，对于自身免疫性或遗传性疾病患者，性腺自体移植对保持生育力无效。在这种情况下，同种异体移植是可能的解决方案。Silber等[13,28]共报道了9对同卵双胞胎，通过卵巢同种异体移植救治不育的一方。另外，原位卵巢同种异体移植已经在Turner综合征的患者中进行。这种技术能够恢复患者正常的月经周期和排卵，维持正常的激素水平，并刺激第二性征的发育。然而，Scott等[29]研究表明，免疫抑制治疗如环孢菌素A联合类固醇是卵巢移植物存活所必需的。

3 影响移植卵巢组织功能的因素

卵泡丢失是卵巢移植后的主要问题之一，其与以下几个方面有关。

3.1 卵巢组织大小 冷冻之前卵巢皮质的厚度对于冷冻保护剂的灌注和确保移植物存活至关重要。为了确保冷冻保护剂的良好渗透和清除，移植物的表面积与体积之比必须很高，降低冻融期间冰冻损伤的可能性以及减少在移植后初始阶段的缺血缺氧。目前普遍通过慢速冷冻或玻璃化方法将卵巢皮质组织冷冻保存在1～2 mm厚的条带中。有学者提出减小移植物的尺寸可能会增加氧气、生长因子和营养物质向缺血移植物的扩散，并改善卵泡的存活率[30]。然而，Gavish等[31]研究表明在小鼠中异种移植牛卵巢组织1周后有广泛新生血管形成，当移植物厚度减少超过1 mm时，并没有发现有益的效果，广泛的原始卵泡丧失和卵泡损伤增加而没有改善新血管形成。此外，移植的卵巢皮质切片仅含有一部分个体的卵巢储备，因此只能在供体移植物中所含的卵母细胞供应消耗之前，为受体提供相对短暂的生育期。这一限制意味着冷冻保存和自体移植的卵巢皮质切片作为恢复老年患者生育能力的一种手段似乎不太有效，这些患者在组织保存时卵泡密度已经很低，并且与内分泌紊乱有关。在这种情况下，整个卵巢的冷冻保存为自体移植提供了一个保存生育力最有效的替代策略，因为其可以恢复卵巢内的所有原始卵泡。此外，由于整个卵巢移植需要血管吻合而不是皮层血运重建，因此这种干预措施不会导致缺血引起的卵巢储备功能显著下降、内分泌紊乱，还可减少限制这种生育力保存技术效果的年龄因素的影响[32]。然而，冻融整个卵巢的自体移植也存在一些缺点，包括：①由于冷冻保护剂在整个卵巢中的扩散不充分以及在卵巢核心和外周之间冷却速度不均匀，在冷冻期间具有较高的冷冻损伤风险；②卵巢血管冷冻损伤；③由于卵巢动脉直径小（≤0.5 mm）、卵巢血管蒂短（≤5 cm），移植物与受体血管的直径不一致以及微血管吻合可能失败，导致血管吻合手术困难；④手术后血管并发症的发生风险较高，如吻合口出血、假性动脉瘤、血管狭窄或微血管血栓形成；⑤卵巢整体的血管并发症可严重影响整个卵巢的存活，使其他方式的移植尝试不再有可能。

3.2 局部缺血 局部缺血是指动脉或静脉血流灌注不足和减少，细胞能量储存耗竭并有导致细胞死亡的毒性代谢产物的积累。持续数日的缺血最可能引起深度和不可逆的缺血-再灌注损伤，是造成卵泡丢失的原因，因为移植物需要4～5 d的时间进行再氧合。一项绵羊卵巢组织移植的研究表明，移植新鲜组织后，65%的卵泡丢失，当冷冻组织融化时会增加7%的卵泡丢失。此外，移植到裸鼠中的新鲜或冷冻人卵巢组织显示卵泡密度降低，表明缺血是卵泡消耗的主要因素。因此，新血管形成之前缺血的持续时间对于卵泡的存活至关重要，并且可能是造成移植后卵泡损失的主要原因。

缺血性损伤的机制涉及能量消耗和再灌注氧化应激，可能导致脂质、DNA、酶和结构蛋白的损伤，从而导致细胞死亡。几种炎症因子的基因表达由缺氧敏感的反应元件和核因子κB（NF-κB）激活，嗜中性粒细胞和巨噬细胞向组织内转移，导致组织破坏和纤维化。然而，由于原始卵泡的代谢需求非常低，其在移植后新生血管形成前相对较长时间缺血的情况下仍能存活。而且，它们分布在卵巢表面之下，从位置上看可能是最先从新血管向内生长中受益的。关于冷冻保存的牛卵巢皮质的研究证实，与原始卵泡相比，基质细胞更易缺血。由于缺血对卵泡池的负面影响，因此血管生成速度是卵泡存活的关键机制。

4 添加外源性物质改善血管生成和卵巢移植

许多动物实验着重于改善卵巢组织的存活。冻融卵巢组织在动物模型中移植可使窦卵泡发育并成功活产。尽管冷冻保存和卵巢组织自体移植获得了成功，但移植也导致大量的卵泡损失[31]。在这方面，许多研究使用抗氧化剂或血管生成因子等进行改善[33-34]。移植前局部注射抗氧化剂维生素E可以提高卵泡存活率。Donnez等[8]研究表明，药物可以刺激移植物的血管再生，如VEGF或鞘氨醇1磷酸（S1P），可以减少抑制物缺血和氧化应激反应。2011年Zelinski等[35]的一项研究表明，S1P及其类似物可以保护灵长目动物的卵巢免受辐射引起的损害。此外，Scalercio等[36]于2015年指出，用维生素E类似物trolox预处理卵巢组织，可以改善卵巢组织的卵泡质量，避免其在基质细胞中发生凋亡。此外，有研究表明，每天给予自体卵巢移植小鼠左旋肉碱，直到术后7 d，可抑制卵泡凋亡、减轻氧化损伤，并提高卵巢移植物中卵泡的存活率和功能[37]。

到目前为止，卵巢冷冻保存和移植程序几乎仅限于无血管皮质切片。无血管吻合的小皮质切片的存活完全依赖于移植后新生血管的形成。为了减少卵巢组织移植后的缺氧时间并改善卵泡存活率，可以通过VEGF刺激血管生成，VEGF是调节新血管形成的主要信号蛋白[21]。已有研究表明，VEGF通过在粒层细胞中表达的两种酪氨酸激酶家族受体起作用，即VEGF受体1（VEGFR-1）和VEGFR-2。有研究使用SCID小鼠异种移植模型分析2种VEGF-A亚型VEGF111和VEGF165的作用[38]。VEGF111是可溶的并且对蛋白水解具有抗性，而VEGF165锚定于细胞外基质。这2种VEGF亚型均可增加血管恢复和功能性血管生成。在胶原蛋白基质中使用VEGF111和VEGF165可以改善移植后卵巢皮质的血管生成并减少缺氧，从而增强原发性卵泡的保存。此外，已证实小鼠异种移植过程中在胶原蛋白基质中用VEGF165包裹卵巢组织，可更快速地发生功能性血管生成和移植物的早期血运重建[21]。此外，Campbell等[32]使用抗血栓形成药物阿司匹林的术后方案来减少移植后局部缺血。

移植冷冻保存的卵巢组织有助于青春前期和育龄期女性或患有癌症、治疗不能延迟需进行辅助生殖技术（如卵母细胞或胚胎冷冻保存）的患者。由于内膜准备和刺激取卵通常需要2～3周或更长的时间，所以一般不可能将成年癌症女性的胚胎冷冻以备将来使用。而且，并非所有的患者都有伴侣可以进行胚胎冷冻保存。此外，与卵母细胞和胚胎相比，年龄和月经周期不影响卵巢组织的冷冻保存，也较少涉及伦理和社会问题。

大多数冻存卵巢组织移植的研究具有重建生育力的目的[37]。然而，在特殊情况下，如当由于癌症或盆腔器官感染需要切除正常卵巢时，卵巢激素的缺乏可能导致内分泌紊乱，如骨质疏松症、性欲减退、性功能障碍和脂蛋白水平增加。这种情况下，冻存卵巢组织的移植是克服该问题的主要方法。然而，尽管冻存卵巢组织移植取得了良好的效果，但成功恢复冻融卵巢皮质生育力的主要障碍是新血管生成前粘连和卵泡大量缺血性损伤。因此，卵巢移植的优化可能需要准备适当的组织厚度和移植的最佳部位，从而避免组织缺血并促进快速血运重建。仍需要进一步的动物模型研究来开发女性卵巢冷冻移植优化方案。

5 结语与展望

综上所述，经低温冷冻保存后的卵巢组织可以保存数量可观的原始卵泡，并且结构完整，具有活力及发育潜能，而且已经直接用于临床成功获得妊娠。因此，将冻存卵巢组织作为保存生育力的方法具有非常广阔的应用前景[39]。这意味着卵巢冷冻移植技术有可能充分利用女/雌性生殖细胞用于人类辅助生殖、建立动物基因库和濒危动物保种等。