MR示踪技术在干细胞治疗心肌梗死中的研究进展

吴诗熳 张 华 姚振威*

目前心肌梗死仍然是威胁人类生命及生活质量的主要原因之一，而自体移植干细胞治疗心肌梗死已逐渐从实验室研究走向临床应用，但仍然面临着诸多困难，其中一个重要限制是移植细胞的示踪和疗效评价。干细胞治疗的机制和功效仍然不确定，目前临床多以心肌的形态学及功能学改变（如心脏射血分数等）来评价干细胞治疗的疗效，但这些评估方法无法有效了解移植干细胞的存活、迁移、转归等生物学特性信息，且无法获悉其在活体内的分布。而研究中使用的示踪剂标记法监测干细胞则必须在离体状态下进行组织切片分析，如通过载体转导等方式改变细胞基因，使其表达特异性的标志物（如荧光素酶和绿色荧光蛋白）[1]；利用染料标记细胞；选用雄性供体和雌性宿主，利用Y染色体作为标志物。这些方法都具有创伤性，难以应用于临床。因此亟需一种无创实时动态提供移植干细胞迁移、生存、分化以及器官功能改善整个过程的全部信息的活体示踪技术。

心脏 MRI（cardiac MRI，CMRI）技术在临床上一直是评价心室功能较全面的无创性成像技术，可准确提供心室容积、质量、形态和功能信息[2]。近年来，多种干细胞标记技术与CMRI技术不断结合，不仅可获得精确的解剖信息，了解心功能及心肌存活状况，还可长时程监测干细胞迁移及生存等情况，即MR细胞示踪成像技术。MR细胞示踪成像通过MRI连续监测，使活体细胞内的特殊分子作为标志物在MR上显示，即把活体内的生物学行为转化为特异性分子影像，从而实现活体状态下定性、定量研究生物体内的组织结构及功能变化[3]，可分为对比剂直接标记细胞示踪成像和MR报告基因成像。MR细胞示踪成像的标志物具有特异性高、亲和力强、半衰期长（保证足够时间成像）、标记率高等特点，同时能在合适的磁场强度下改变弛豫率，最小检测单位可达细胞水平[4]。本文综述MR细胞示踪成像技术的研究进展。

1 MR标记细胞示踪成像

1.1 顺磁性对比剂 MRI对比剂是通过缩短组织纵向弛豫时间或横向弛豫时间，使得T1WI或T2WI上的目标成像区域产生高信号和低信号，从而达到区分目标区域和周围组织的效果。T1阳性对比剂[如钆（Gd3+）和锰（Mn2+）对比剂]能通过顺磁金属离子外壳中的不成对电子与附近水分子的直接相互作用来缩短T1，在T1WI上呈现高信号。钆对比剂（Gd－DTPA）属于细胞外阳性对比剂，其细胞标记效率低，且标记后的钆存在于细胞内，需较高浓度才能产生正性T1对比效应，因此近年来钆对比剂用于心肌梗死的干细胞研究逐渐变少。Adler等[5]采用新型对比剂GdFM-Cy3标记鼠胚胎干细胞衍生的心血管祖细胞，GdFM-Cy3的纵向弛豫率约为Gd-DTPA的6倍，且能在标记细胞和对照细胞之间迁移，经细胞排泄后其相邻细胞仍能再摄取，避免了MR标志物的稀释，克服了传统钆剂标记细胞中的细胞内区室化问题，减少细胞内区室化对纵向弛豫率的影响。但由于未螯合的钆具有高毒性，对含钆的对比剂应用于干细胞追踪的安全担忧依然存在。为减少钆信号的丢失和毒性，Carney等[6]合成了基于亲脂性Gd（Ⅲ）的MR对比剂，可在体外标记细胞膜，通过增加钆的有效负载从而放大MRI信号，但该研究应用于肿瘤细胞，与干细胞治疗的作用模式不能类比，因此钆剂标记干细胞的技术还需要更多的探索。

另一种顺磁性对比剂为氯化锰（MnCl2），锰以离子状态即可作为细胞标志物，不需要借助其他转染物质。MnCl2有望提高MRI活体示踪干细胞的敏感性，Yamada等[7]研究表明MRI可示踪亚毫摩尔浓度MnCl2标记的移植干细胞，并评价干细胞在心肌梗死治疗中的活性。2018年，Liu等[8]利用与锰离子螯合的黑色素（MNP-Mn）成功标记了骨髓间充质干细胞，表明MNP-Mn具有高的生物相容性。黑色素广泛存在于人体，具有良好的金属离子螯合能力，虽然该研究未用于心肌梗死治疗的评价，但未来可以利用体内类似的金属离子螯合物作为靶点进行研究，将锰对比剂用于标记心肌梗死治疗的干细胞，可能安全性更高且更容易推广到临床。

1.2 化学交换饱和转移（chemical exchange saturation transfer，CEST）成像相关对比剂 CEST成像是使用射频脉冲选择性地饱和特定物质（例如蛋白质或多肽的酰胺质子、葡萄糖、黏多糖等），这种饱和通过化学交换，进一步影响自由水的信号强度，因此通过检测水的信号，可间接反映这种物质的信号。 Pumphrey 等[9]用铕-10-（2-羟丙基）－1，4，7－四氮杂环十二烷－1，4，7－三乙酸（Eu-HPDO3A）标记同源和非同源的骨骼肌成肌细胞（C2C12）并植入C57B6/J小鼠的心肌中，通过CEST预测这种带有分化潜能的成肌细胞在心肌梗死模型中的疗效。Eu与Gd一样具有潜在的生物毒性。现有更多更安全的CEST相关标志物已用于心肌梗死干细胞示踪研究，如CEST报告基因表达的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶蛋白[10]（HSV1－TK），以及非金属 CEST 大分子如赖氨酸蛋白[11]等。

1.3 氧化铁类对比剂 氧化铁类对比剂通过直接胞吞、转染试剂介导胞吞及电穿孔法等技术标记组织细胞，方法简单、安全有效。此类对比剂根据直径大小分为超微超顺磁性氧化铁（USPIO）、单晶氧化铁纳米复合物 （monocrystallineiron oxide nanocompound,MION）、超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)，其中SPIO已成功用于心肌梗死诊断[12]。SPIO能引起组织局部磁场不均匀，从而缩短质子去相位的弛豫时间，产生负性T2对比效应，而对T1弛豫影响较小，所以观察SPIO标记细胞在体内的生物过程应选择T2加权成像。随着多种MR技术的发展，氧化铁类对比剂在MR细胞示踪技术研究中也将有新的进展。如T2*map序列较传统T2序列能更敏感地检测出USPIO标记的干细胞[13]，还有基于超短回波时间（ultr ashort TE，U TE）的序列可以进行SPIO的阳性对比成像[14]。

传统SPIO标记干细胞的最佳终质量浓度为50 μg/mL[15]，而新型 Molday IONRhodamine-BTMSPIO可低至20μg/mL[16]。除了改变SPIO相关对比剂的结构本身，若SPIO相关对比剂能在其周围形成蛋白冠，所标记的干细胞在MR成像示踪效果会更好[17]，从而克服转染剂介导胞吞SPIO引起纳米粒子沉淀等缺点[18]。Khurana等[19]直接静脉注射SPIO可有效标记体内间充质干细胞，并且能通过MR成像追踪干细胞移植，该技术的成功应用降低了体外标记间充质干细胞程序中污染和生物改建的危险[19]，可直接应用于临床；而SPIO对外在磁场较敏感，其在浓度较低时就能使标记细胞达到所需的显影效果。另外，改变标记细胞输送的途径或许能增加细胞存活率，Gao等[20]发现通过逆行冠状静脉输注能使SPIO标记的间充质干细胞 （m esenchymal stemcel l，M SC）有效存活。MRI不仅能实现标记干细胞后的跟踪，还可以实时监控SPIO标记干细胞注射，通过不断调整注射剂量和方式来保证标记后的干细胞到达靶区[18]。

然而，SPIO虽可成功标记干细胞，但其磁性标志物会随着细胞代谢和分裂分化而逐渐消失（即稀释作用[21]），且随着T2延长而不能长期有效示踪细胞。而且SPIO特异性较低，MRI仅能通过因铁颗粒引起的低信号间接判断干细胞的存在，却不能区分铁颗粒到底是在干细胞内、巨噬细胞内还是在细胞间质，因此SPIO示踪法不能反映移植干细胞的存活，检测到的信号存在假阳性[22]。Ma等[23]发现MRI无法区分检测到的SPIO信号是来自成功定植的干细胞还是吞噬了SPIO的巨噬细胞。为克服SPIO假阳性的局限，近年来对SPIO标记干细胞的研究趋向于双标记法，如Ngen等[24]使用钆剂和铁剂同时标记，使活细胞主要为负性T2/T2*效应，在死细胞附近主要产生扩散的阳性T1信号，通过MRI双对比方法实时成像移植干细胞。Hitchens等[25]研究发现SPIO和全氟化碳（PFC）试剂均能缩短19F-MRI的T2值，因此存在于巨噬细胞的SPIO在19F-MRI上的信号可通过消除从死细胞转移到巨噬细胞的PFC信号，使得影像上仅为活细胞的PFC产生的信号，从而消除干细胞分布的假阳性影像。但SPIO能被吸收进入人体铁循环代谢，而PFC和钆不能为人体代谢，因此这些技术推广到临床应用具有一定的难度。

2 MR报告基因成像

MR报告基因成像是通过特定程序重新整合靶细胞的基因，使其稳定表达导致MR信号改变的物质，如某些受体、酶类（包括变构酶）等，该方法不需要外源性对比剂，为间接标记成像[26]。由于只有存活的移植干细胞才可以持续表达改变MR信号的物质，因此报告基因成像可以提供心肌梗死治疗中移植干细胞的存活状况[27]。Vandsburger等[28]提出目前主要的报告基因为：①酶相关报告基因，主要包括肌酸激酶、β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶等报告基因；②受体相关报告基因，主要包括转铁蛋白受体等报告基因；③CEST相关报告基因；④其他类型的报告基因。目前在动物实验中已有几种经过验证的MR报告基因，包括肌酸激酶、铁储存蛋白（如铁蛋白，转铁蛋白和转铁蛋白受体）和人工蛋白（如富含赖氨酸的蛋白），可特异性识别存活干细胞并长期示踪干细胞[29]，其中以过表达铁蛋白作为MRI报告基因在心肌梗死模型的研究应用最多。

2.1 过表达铁蛋白 细胞内的储存铁是通过细胞膜上的转铁蛋白受体（TfR）把细胞外转铁蛋白的铁转运到细胞中，再由细胞内的铁蛋白储存铁。体内铁蛋白过表达在MRI上产生的对比度不会随细胞分裂、增殖而减少，与标记细胞的氧化铁纳米颗粒所产生的对比度相比，其更加稳定。此外，即使在缺血条件下，铁蛋白过表达细胞始终能积累足够的铁，仍能在MRI上产生强烈的R2/R2*对比。

Naumova等[30]最早在心肌梗死模型中采用过表达铁蛋白的基因作为MR报告基因，将野生型的成骨骼肌细胞（C2C12）和铁蛋白过度表达基因修饰的C2C12分别移植到对照组和实验组小鼠的梗死心脏中，移植3周后通过T2*序列检测，实验组小鼠的心脏MR影像中可见低信号区域 （由过度表达的铁蛋白复合物中铁积累引起），而对照组小鼠心脏中未见该区域有MR信号变化；经组织学证实2组小鼠心脏都有骨骼肌移植物存在，证实了过表达铁蛋白的干细胞基因修饰技术能使移植后的干细胞产生足够的MR对比度，从而使其在体内可连续监测。Campan等[31]利用人铁蛋白重链（hFTH）作为报告基因，使干细胞过量表达铁蛋白，从而使存活的干细胞能在心脏MRI产生信号，实现干细胞示踪。上述2项研究均发现铁蛋白重链的过度表达不影响细胞生存和增殖，揭示了使用铁蛋白过表达的基因作为MRI报告基因的潜力，有利于在MRI上观察到成功植入且在梗死区域存活并增殖的干细胞。

2.2 膜结合受体靶抗原 Chung等[32]通过基因再造使胚胎干细胞表达血凝素酸 （hemagglutinin acid，HA）及myc表面抗原，随后将USPIO共价结合于抗HA及myc抗原的单克隆抗体上，将标记后的单克隆抗体与HA及myc抗原阳性干细胞共培养5 d后，移植到心肌梗死动物模型中，相应移植区MR信号强度降低，结合HE染色证实了该MR信号降低区域为移植干细胞聚集区。该研究发现以膜结合受体靶抗原作为MRI报告基因不仅能解决传统SPIO特异性低、不能证实移植细胞存活状况的局限，还能有效克服基于铁蛋白报告基因成像敏感度低等问题。

2.3 具有多重功能的MRI报告基因 多能干细胞在梗死的心肌区可分化成为新生心肌细胞，同时还有形成肿瘤性畸胎瘤的风险。Neyrinck等[33]不但将人类生长抑素受体2型（human somatostatin receptor type 2，hSSTr2）用作成像报告基因，还将其用作放射性核素治疗的自杀机关，保证多能干细胞衍生细胞治疗心肌梗死的安全性。在Liu等[34]研究中，转导酪氨酸酶报告基因的MSC聚集区域不仅在MRI上有明显改变，还可在光声成像、PET的影像上有突出的信号改变，而注射非转导MSC或假手术的大鼠未见信号，该技术能通过多种成像手段对酪氨酸酶报告基因稳定转导的MSC进行监测，为检测移植干细胞的活性、分布、定植时间提供了可行且可靠的方法，且与其他外源报告基因相比，酪氨酸酶表现出较低的毒性和较少的免疫反应。

MR报告基因成像技术是MR在基因水平上对靶细胞的示踪，相对于直接标记成像，该技术更复杂且要求更严。基因再造对标记细胞的生物学特性的影响、标记细胞内报告基因产物的蓄积、外源抗原引起的宿主免疫反应等这些可能出现的问题都有待更深一步的研究。目前，MR报告基因成像技术尚处于基础研究阶段，用于临床研究还有较大距离。

3 总结与展望

MR分子成像具有无创、信号不受组织深度的限制，可同时提供移植细胞周围的生理及组织结构信息等特点，但仍面临许多突出的问题：①稀释作用：移植干细胞存在不均等分裂的现象[11]，随着分裂分化标志物浓度不断降低；②标志物对细胞的潜在毒性；③标记细胞的存活状态的特异性显示等。这些问题的解决需要进一步研究新型更安全、更有效的MR标志物。在应用MR时还要考虑有外在磁场时活体内金属移植物和对生物体整体的影响。MRI技术本身也需要提高，除了高场强条件外，更多新序列的研发会使细胞示踪的结果更可靠，如非共振饱和度（off-resonance saturation）序列能使超顺磁性铁对比剂显示为阳性信号，减少气泡和伪影的干扰[35]。而MR报告基因成像一定程度上克服了传统对比剂标记细胞成像的低特异性，而且更能指示出真实的新生心肌区域，但是外源成像基因引入对细胞的安全性等都需要更多的实验去证实。

总之，目前虽没有影像技术完全达到理想要求，但现有的MR细胞示踪技术为自体移植干细胞治疗的评价提供了一定的依据和可能。理想的报告基因表达应可被诱导型启动子调节，通过最小化报告基因对细胞本身增殖、迁移、分化的影响来增加安全性[36]。且由于干细胞具有多向分化潜能，即使分化为其他类型的细胞也同样会表达改变MR信号的物质，而临床上应用需要观察的只是干细胞分化为心肌细胞的特定部分。只有当干细胞向心肌细胞分化才会显像这一研究成果转化到临床应用才更有价值，因此利用肌动蛋白启动报告基因表达的MR报告基因成像可能成为今后的研究热点。随着研究的不断深入，应用于干细胞移植治疗心肌梗死中的MR活体示踪技术会有新的突破，促进自体干细胞细胞移植治疗更有效、安全地转化到临床应用。