植物microRNA跨界调控哺乳动物基因表达研究进展

彭朦媛，王颖芳,2

(1.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006； 2.广东省局部精准药物递药制剂工程技术研究中心，广东 广州 510006)

越来越多研究表明，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是影响发育和疾病相关基因和基因组的关键调控者[1]，主要包括微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等。miRNA是一类小的(18～24 nt)内源基因编码的非编码单链RNA分子，传递基于DNA的表观遗传信息，广泛存在于真核生物中，在许多已知物种的进化中保守[2]。这些miRNA参与动物和植物中的转录后基因表达调控，在基因表达中起着至关重要的作用，其作用方式主要有以下3种[3]：①翻译抑制；②mRNA衰变(降解)；③mRNA切割。miRNA可以通过序列互补配对，结合到靶基因mRNA上，特别是mRNA的3′端非翻译区，使其去稳定化或阻止mRNA的翻译来沉默基因[4]。动物miRNA与其靶mRNA显示出广泛的互补性，miRNA种子区域[5]中的核苷酸序列与靶mRNA的结合可抑制靶mRNA翻译成蛋白质[6]。植物miRNA与靶mRNA具有高度互补性[7]，诱导靶mRNA切割。miRNA调控关键的生物过程，如细胞凋亡、代谢、免疫反应、激素信号传导、细胞增殖、分化等。在植物中，miRNA还在开花、营养稳态、生物和非生物胁迫反应中发挥作用。

一直以来，对动植物miRNA的研究局限在其各自的物种内，且RNA有不稳定、易降解的特性，很难想象miRNA能产生跨界调控作用。即使有，也多存在于植物与昆虫[8-9]、动物与寄生虫[10]之间。但近年来这种观点被打破，据报道，植物miRNA可以进入动物体内行使功能，表明miRNA可能是药用植物发挥疗效的物质基础，可能是药用植物中隐藏的生物活性成分之一。

植物来源的miRNA成功改变生物体的基因表达需要以下关键步骤[11]:(1)植物中有足够多的生物可利用的miRNA，且具有一定的稳定性；(2)穿过消化道屏障，在细胞外保持稳定；(3)细胞摄取(分子吸收机制)；(4)特定靶基因的转录后表达的改变。

1 植物miRNA在制备过程中稳定

关于功能性植物miRNA的一个关键问题是其在制备过程中的稳定性。众所周知，植物在进入体内被消化之前通常经过干燥、储存、煎煮等处理。作为潜在的生物活性成分，植物miRNA的稳定性是它们在体内发挥作用的前提条件。

人们普遍认为植物经过煎煮等处理，可能导致miRNA的酶解或热降解。实际上，大多数植物miRNA在煎煮30 min后降解[12]。然而，一些植物miRNA(miR166、miR167、miR168和miR159等)据报道是稳定的，如水稻、大豆、马铃薯、西兰花和卷心菜等植物经过储存、烹饪等处理后仍可检测到miRNA[13-16]。李明洲等[17]将玉米煮熟并评估其中的miRNA水平，发现植物miRNA在一定程度上对恶劣的烹饪条件具有抗性。

张辰宇等[12]在金银花水煎液中检测到稳定存在的miR2911，猜测miR2911的稳定性基于其特定序列和高GC含量。王颖芳等[18]通过qRT-PCR证明人参经过煎煮之后仍存在miRNA。Xie等[19]通过茎环qRT-PCR定量评估各种槲寄生(ViscumalbumL.)提取物(新鲜槲寄生冻干粉、新鲜槲寄生的提取物冻干粉、干燥槲寄生80 ℃浸泡10 min后的提取物冻干粉、干燥槲寄生煮沸30 min后的提取物冻干粉)中5种高表达的miRNA的稳定性，结果在大多数提取物中可检测到miRNA，表明植物经过处理仍存在miRNA。

植物经过煎煮等制备过程后仍可以检测到miRNA，表明部分miRNA在制备过程中保持稳定。其他miRNA能否在这些过程中存在及可能降解的程度仍需要进一步研究。

2 植物miRNA穿过动物体消化道屏障

外源性植物miRNA通过胃肠道(GI)进入体内行使功能，需要穿过消化道屏障。在胃酸环境下，大多数植物miRNA和哺乳动物miRNA可存活至少6 h，植物miRNA比动物miRNA降解慢，可能是植物miRNA的3′末端具有甲基化修饰，使其更稳定[13]。植物miRNA到达肠道后，被小肠上皮细胞摄取吸收，以囊泡的形式释放入血，进入循环系统发挥作用。

研究证明，大部分植物miRNA进入动物体内后被囊泡包裹[13-14]。这些囊泡是细胞间进行信号传递的重要载体，根据来源可分为脱落囊泡、外泌体和凋亡小体[20-21]。这些由细胞主动分泌的膜囊泡，含有特异的蛋白、脂质和核酸，可以保护miRNA免受RNases降解[22]，也可能是miRNA到达靶器官发挥靶向作用的原因。miRNA是一种信号传导物质，特别是在脂质衍生的载体内，可用作某些疾病的生物标志物。

还有一部分miRNA不能被囊泡包裹。对于这部分miRNA，内源性miRNA可以通过与脂蛋白[23]或AGO蛋白[24]结合而被运输到靶器官，从而发挥作用。

3 在动物体内检测到植物miRNA

外源性植物miRNA可被动物直接从食物中吸收,且存在于血浆、组织和体液中。C57BL/6小鼠在喂食玉米和含有大豆的饲料后，在其血浆、肝脏和粪便样品中检测到丰富的大豆和玉米miRNA[25]。猪经喂食新鲜玉米7 d后，在其血清和组织中检测到玉米衍生的miRNA，且通过高碘酸氧化反应证明了这些植物miRNA的存在[17]。

健康志愿者服用西瓜汁和多种水果混合的果汁后，用qRT-PCR在其血浆中检测到miR156a、miR157a、miR162a、miR172a、miR390a和miR168a等植物miRNA并通过Northern印迹杂交(Northern blot)验证[26]。健康志愿者的母乳(全脂乳和外泌体)经qRT-PCR检测到5种植物食物衍生的miRNA(miR166a、miR156a、miR157a、miR172a和miR168a)的存在[27]。

通过对大数据进行分析，进一步说明植物miRNA广泛存在于动物体内。Zhao等[28]分析11种来自人类体液或组织中的388个小RNA测序数据，在至少1种样品中总共发现166种植物miRNA，其中14种植物miRNA占人类样品中总植物miRNA丰度的80%以上，这验证了外源性植物miRNA假说。同时，该研究用一组带有同位素的合成miRNA喂食动物后进行原位检测作为对照[28]。Liu等[29]从410个人血浆小RNA测序数据集中鉴定了丰富的植物miRNA序列，发现miR2910在血浆样品中相对含量较高，该miRNA是在水果和蔬菜中一种保守的特定植物miRNA。Lukasik等[30]对公开可用的人和猪母乳外泌体中miRNA高通量测序原始数据进行生物信息学分析，发现在人类样品中ATH-miR166a、PAB-miR951、PTC-miR472a和BDI-miR168丰度最高，而在猪母乳外泌体中ZMA-miR168a、ZMA-miR156a和ATH-miR166a丰度最大。

4 植物miRNA靶向哺乳动物靶基因

4.1 调节脂质代谢的miR168a

植物来源的miR-168a最早被证明靶向动物靶基因。miR168a在水稻中含量丰富，是中国受试者血清中富集度最高的外源植物miRNA之一。通过计算机模拟靶基因，miR168a显示出与哺乳动物低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(LDLRAP1)的外显子4有高度互补性。体外和体内研究表明，miR168a可与小鼠LDLRAP1 mRNA结合，降低肝脏LDLRAP1蛋白水平[13]。LDLRAP1 mRNA编码富含活性的网格蛋白相关分选蛋白(CLASP)，有助于去除低密度脂蛋白(LDL)[31]，这就解释了为什么miR168a进入体内可能会导致血浆LDL以及胆固醇含量的升高，造成动物体内脂质代谢异常。

4.2 抗病毒的miR2911

miR2911是中药中鉴定的第一个直接靶向各种甲型流感病毒(IAV)的活性成分。miR2911是一种金银花编码的非典型microRNA。张辰宇团队[12]研究发现，饮用金银花煎液可导致小鼠外周血和肺中miR2911水平升高。荧光素酶报告基因实验和生物信息学预测表明，miR2911能够广谱靶向IAV，特别是H1N1、H5N1和H7N9。体内和体外实验证实，金银花水煎液和合成的miR2911均能抑制H1N1病毒编码的PB2和NS1蛋白表达并降低染病小鼠的死亡率[12]。金银花水煎液中加入miR2911拮抗剂后导致其抑制作用降低，进一步表明miR2911确实能够抑制H1N1、H5N1和H7N9病毒复制。金银花作为传统中药，具有清热解毒、抗菌消炎的作用，在我国已有数百年的用药历史，目前发现的miR2911抗病毒作用与其清热解毒的传统功效一致。

4.3 抗肿瘤的miR159和miR156

miR159是首个证明的能够抑制哺乳动物的肿瘤生长的植物miRNA。在西方受试者的血清中检测到miR159，发现其在血清中的丰度与乳腺癌发病率和进展呈负相关[14]。miR159主要在细胞外囊泡中被检测到，表现出对高碘酸钠的氧化抗性，表明其为植物miRNA。与动物miRNA相比，植物miRNA因在末端核糖上有2′-O-甲基化修饰而抗高碘酸钠氧化。通过使用软件DIANA microT v3.0的计算预测、用合成miR159转染MDA-MB-231细胞后基于RNA-Seq的基因表达谱和RISCTRAP测定3种独立的方法，筛选出miR159在人体内的靶基因。体外实验显示，合成的miR159能够通过靶向转录因子7(TCF7)mRNA的3′非翻译区(UTR)来抑制乳腺癌细胞的增殖，降低MYC蛋白水平。同时，给小鼠灌胃miR159可显著抑制其乳腺肿瘤的生长。

西兰花高通量测序结果显示，miR156a的表达量最高。西兰花具有抗肿瘤特性，其miRNA可能也有抗肿瘤作用。体外研究显示，合成的miR156a模拟物抑制人鼻咽癌(NPC)细胞的上皮-间质转化(EMT)。EMT与癌症发展和转移相关。荧光素酶报告基因实验和蛋白质印迹实验表明，连接黏附分子A(JAMA)是miR156a模拟物的靶标[32]。JAMA属于紧密连接蛋白家族，影响细胞形态和迁移。实验结果证明，miR156a模拟物通过靶向JAMA的3′UTR区来抑制NPC细胞的EMT，并参与体外p-Akt的激活[32]。

4.4 其他植物miRNA

目前，通过生物信息学的方法预测植物miRNA靶基因的方法越来越成熟，已经建立了多个数据库和分析软件如Xeno-miRNet[33]、IIKmTA[34]、MirCompare[35]等来预测植物miRNA在动物体内的靶基因。

喜树(Camptothecaacuminata)是一种重要的以抗癌潜力而闻名的药用植物。通过计算机系统生物学方法，对喜树的miRNA进行靶基因预测，发现14种miRNA调节人类的152种靶基因。进行靶基因的功能富集、基因-疾病关联和网络分析，发现mTOR信号通路的途径与靶基因显著相关，一些重要的中枢蛋白如GSK3B、NUMB、PEG3、ITGA2和DLG2与癌相关通路的关联[36]，这与其抗癌作用一致。

槲寄生是一味传统中药，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、安胎等功效。结合TargetScan、miRanda、PITA和RNAhybrid方法用于预测槲寄生在人类中的靶基因，发现14 559个预测靶标在33个KEGG通路中高度富集，这KEGG途径与癌症、心血管疾病和神经系统疾病有关[37]。

植物miRNAmiR2910被发现具有与hsa-miR-4259和hsa-miR-4715-5p相同的靶序列，预测其靶向人JAK-STAT信号传导途径基因SPRY4和转录调节基因[29]。预测的miRNA似乎在某些通路调节中具有潜在的重要作用，需要进一步的验证。

以上这些植物miRNA，仅经过生物信息学的方法预测其在人体内的靶基因，具体在某些疾病或通路中起作用需要进一步实验验证。

5 小结与展望

综上表明，植物miRNA广泛存在于各种植物中，可以被动物摄取通过胃肠道进入体内发挥靶向治疗作用。植物miRNA在到达靶器官之前保持稳定是其发挥治疗作用的前提。植物miRNA在3′末端核糖上进行甲基化修饰使其具有较高的稳定性，被囊泡包裹后运输到靶器官以防止被RNases降解，这为其发挥治疗作用提供了可能。

植物miRNA的跨界调控确实存在且表现出巨大的治疗潜力。如金银花的miR2911靶向流感病毒并保护小鼠免受流感感染。植物来源的miR159通过靶向TCF7显著抑制乳腺癌细胞增殖。这些植物miRNA表现出的抗病毒、抗肿瘤的活性为人类疾病的治疗提供了新思路。

中药包括药用植物，考虑到植物miRNA的跨界调控作用，miRNA可能是药用植物发挥疗效的物质基础，是一类新的生物活性成分。中药的物质基础研究和药效学研究可以尝试从中药miRNA相关方面开始进行，同时也应该考虑其潜在的风险。