响应面法优化酱油蛋白质利用率的发酵条件

（四川工商职业技术学院酒类与食品工程系，四川都江堰611830）

酱油是我国传统的酿造调味品，营养丰富且风味独特，含有多种氨基酸、有机化合物和矿物质[1]。长期以来，酿造酱油是以大豆或者豆粕等植物蛋白为主要原料，以淀粉质原料为辅料，经米曲霉制曲、发酵酿制而成[2]，根据酿造工艺主要分为高盐稀态发酵法和低盐固态发酵法[3]。高盐稀态发酵法工艺周期长，设备利用率低，投资大，产品成本高[4]，相反低盐固态发酵法因其周期短，原料价格低廉而被广泛用于酱油发酵。响应面分析是Box及其合作者于20世纪50年代创立的一种计算最佳试验条件的方法，通过对各因子与结果之间的关系进行函数化，可分析出各因子之间及与结果的相互影响，得出最优条件[5]。

国内酱油生产还存在原料利用率低、浪费严重的问题[6]，因此本研究以非转基因大豆为蛋白质原料，采用低盐固态发酵工艺，利用响应面分析法分析，旨在优化低盐固态发酵条件，提高原料利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

非转基因大豆：市售；米曲霉CICC 2016、黑曲霉CICC 2039：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

SKD-1000凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司；HH-1恒温水浴锅：常州万合仪器制造有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程[7]

原料→润水→蒸煮→冷却→接种→制曲→发酵→淋油→成品

1.2.2 蛋白质利用率测定

参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[8]，利用凯氏定氮仪测定原料中蛋白质含量以及不同条件下酱油中蛋白质含量，即可计算出蛋白质利用率，公式如下：

蛋白质利用率/%=酱油蛋白质总量/原料蛋白质总量×100

1.2.3 单因素试验

将发酵影响因子进行梯度化设计安排，以确定最佳值，其中米曲霉和黑曲霉体积比为 1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，发酵温度为 15、25、35、45、55 ℃，发酵时间为 60、80、100、120、140 d，拌曲盐水浓度为 8%、10%、12%、14%、16%。依照上述条件进行单因素试验，确定单因素最佳发酵条件。

1.2.4 发酵工艺最优参数的确定

以蛋白质利用率为评价指标，依次进行米曲霉和黑曲霉比例、发酵温度、发酵时间、拌曲盐水浓度的单因素试验，并确定四因素三水平的最佳参数进行响应面分析。试验设计水平及编码见表1。

表1 响应面试验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 米曲霉和黑曲霉比例对蛋白质利用率的影响米曲霉和黑曲霉比例对蛋白质利用率的影响结果见图1。

图1 米曲霉和黑曲霉比例对蛋白质利用率的影响Fig.1 Influence of Aspergillus oryzae and Aspergillus Niger ratio on the utilization ratio

从图1中可得出，米曲霉和黑曲霉比例对蛋白利用率有一定的影响，比例在1∶3和2∶1之间时，蛋白质利用率随着比例增大而升高，且2∶1时利用率最高为85.59%，比例继续增大利用率降低，可能是米曲霉和黑曲霉分泌的蛋白酶不同所导致[9]，米曲霉主要分泌中性和碱性蛋白酶，黑曲霉主要为酸性蛋白酶，当两者比例为2∶1时，所产生的蛋白酶效果最好。

2.1.2 发酵温度对蛋白质利用率的影响

发酵温度对蛋白质利用率的影响结果见图2。

图2 发酵温度对蛋白质利用率的影响Fig.2 Influence of fermentation temperature on the utilization ratio

从图2可以看出，在温度为15℃到45℃之间，随着温度升高蛋白质利用率逐渐增大，45℃时蛋白质利用率最大，为86.89%。发酵温度和酶活力有一定关系，因为酶有最适发酵温度，过高过低都会降低酶活力，从而导致蛋白质利用率降低[10]。

2.1.3 发酵时间对蛋白质利用率的影响

发酵时间对蛋白质利用率的影响结果见图3。

图3 发酵时间对蛋白质利用率的影响Fig.3 Influence of fermentation time on the utilization ratio

如图3所示，发酵时间在60 d～100 d之间时，随着时间延长，蛋白质利用率逐渐增大，100 d～140 d之间时，蛋白质利用率随之降低，发酵时间为100 d时，蛋白质利用率最大，为86.89%。

2.1.4 拌曲盐水浓度对蛋白质利用率的影响

拌曲盐水浓度对蛋白质利用率的影响结果见图4。

图4 拌曲盐水浓度对蛋白质利用率的影响Fig.4 Influence of concentration of the brine on the utilization ratio

由图4可知，拌曲盐水浓度在8%～12%之间，蛋白质利用率逐渐增大，拌曲盐水浓度在12%～16%之间，蛋白质利用率随之减小，拌曲浓度为12%时蛋白质利用率最大86.78%。食盐有抑制微生物生长的作用，同时对酶活力也有抑制作用，浓度过高时致使蛋白质利用率降低[11]。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

根据Box-Behnken中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，以米曲霉和黑曲霉（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、拌曲盐水浓度（D）为试验因素设计了四因素三水平的响应面分析试验，试验设计及结果见表2。

2.2.2 响应面试验及方差分析

利用Design Expert软件中的Box-Behnken Design模型对表2数据进行二次响应面回归分析，得到回归方程为：

表2 Box-Behnken响应面试验设计与结果Table 2 Results of response surface experiment

Y=88.35+1.03A-1.16B+0.52C+0.019D-0.92AB-1.39AC+0.052AD-0.91BC+0.21BD-0.02CD-6.35A2-0.34B2-4.39C2-9.18D2，模型方差分析及回归系数显著性检验结果如表3所示。

表3 回归方程各项的方差分析Table 3 Variance analysis for each item of the regression equation for ACE inhibitory activity of products as a function of four variables

从表3中可知，蛋白质利用率的一次项和二次项极其显著，从而得知各因素对响应值的影响不是简单的一次性关系，各因素之间的交互作用较好，构成了整个响应面结果。同时，总回归项极为显著，证明方程拟合程度较好，说明试验可信性和准确性较高，失拟项极不显著，说明试验误差很小。通过Design-Expert软件分析得出，最佳发酵条件为：米曲霉∶黑曲霉=2.09∶1、发酵温度42.86℃、发酵时间101.21 d、拌曲盐水浓度12%，蛋白质利用率的理论值为89.03%。

2.2.3 响应曲面分析

通过软件分析得出米曲霉和黑曲霉（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）和拌曲盐水浓度（D）对蛋白质利用率的影响[12]，结果如图5～图10。

图5 米曲霉∶黑曲霉和发酵温度对蛋白质利用率影响的响应面Fig.5 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different Aspergillus oryzae-to-Aspergillus Niger ratio and fermentation temperature

图6 米曲霉∶黑曲霉和发酵时间对蛋白质利用率影响的响应面Fig.6 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different Aspergillus oryzae-to-Aspergillus Niger ratio and fermentation time

图7 米曲霉∶黑曲霉和拌曲盐水浓度对蛋白质利用率影响的响应面Fig.7 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different Aspergillus oryzae-to-Aspergillus Niger ratio and concentration of the brine

图8 发酵温度和发酵时间对蛋白质利用率影响的响应面Fig.8 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different fermentation temperature and fermentation time

图9 发酵温度和拌曲盐水浓度对蛋白质利用率影响的响应面Fig.9 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different fermentation temperature and concentration of the brine

图10 发酵时间和拌曲盐水浓度蛋白质利用率影响的响应面Fig.10 Response surface plot for the utilization ratio of protein of products under different fermentation time and concentration of the brine

由响应面图5～图10可知，4个因子对响应值的敏感程度，米曲霉：黑曲霉响应曲面最陡峭，对蛋白质利用率作用最显著，其次是发酵时间，再次是发酵温度，最后是拌曲盐水浓度。

2.2.4 验证试验

验证试验结果见表4。

表4 最佳发酵条件验证试验Table 4 The validation for the optimal fermentation condition

考虑实际操作条件，将上述最佳发酵条件修正为米曲霉∶黑曲霉=2.09∶1（体积比）、发酵温度 43 ℃、发酵时间101 d、拌曲盐水浓度12%。该条件下平行3次测定蛋白质利用率均值为88.99%，相对误差为0.35%，表明该方程与实际情况拟合很好，具有一定的指导意义。

3 结论

通过单因素试验得出发酵因素水平范围，利用Box-Behnken四因素三水平试验设计优化因素水平，应用Design-Expert软件对试验进行结果分析，以蛋白质利用率为指标得出最佳发酵条件，即米曲霉∶黑曲霉=2.09∶1（体积比）、发酵温度 43℃、发酵时间 101 d、拌曲盐水浓度12%，蛋白质利用率为88.99%，与理论值基本相符。在此发酵条件下，能更有效的利用蛋白质，减少原料的浪费，同时可得到良好风味的酱油，为工业发酵利用提供试验基础。