新辅助化疗联合保肢手术治疗骨肉瘤的疗效分析

耿晓林，周迎锋，贾金领，马超，徐海斌

（新乡医学院第一附属医院 骨外科一病区，河南 卫辉 453100）

骨肉瘤是多见于20岁以下的青少年和儿童恶性骨肿瘤，占小儿肿瘤发病率的5%左右。骨肉瘤进展迅速，早期行肿瘤切除治疗是改善治疗结局、延长患者生存时间的最佳方法[1-2]。随着外科技术的进展，骨肉瘤保肢术成为目前早期骨肉瘤患者的主要治疗方式，该术式对患者的肢体功能及生活质量均具有极大提高作用，但是较多学者对于其肿瘤复发转移率方面的忧虑一直存在。如何最大程度杀灭恶性肿瘤细胞活性，增加保肢手术成功率是目前临床研究的重点。新辅助化疗是指实施局部治疗前做的全身化疗，其目的为缩小肿瘤、早期杀灭局部转移灶，为后续手术及放化疗奠定基础[3-4]。目前关于新辅助化疗在骨肉瘤手术中的应用效果研究仍较少，本研究初步阐述新辅助化疗联合保肢手术对骨肉瘤患者疾病恶性程度及远期预后的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2002年7月—2010年1月新乡医学院第一附属医院收治的骨肉瘤患者78例作为研究对象。纳入标准：①经组织病理学确诊为骨肉瘤；②未发生远处转移；③凝血功能正常；④签署知情同意书。排除标准：①继发性骨肉瘤；②伴严重心肝肾功能不全；③入院前3个月外科手术史；④伴自身免疫性疾病；⑤中途中断新辅助化疗；⑥患者本人或者家属自愿放弃治疗。

按照随机数字表法将入组患者分为对照组和观察组，每组39例。对照组：男性20例，女性19例；年龄9～41岁，平均（17.38±6.19）岁；股骨远端17例、胫骨近端12例、肱骨近端5例、其他5例。观察组：男性21例，女性18例；年龄6～38岁，平均（18.19±6.55）岁；股骨远端15例、胫骨近端13例、肱骨近端6例、其他5例。两组患者基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会成员讨论并批准。

1.2 治疗方法

对照组患者接受保肢手术治疗，具体如下：①肿瘤骨段切除。明确肿瘤切除的确切范围，以核磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）及骨扫描结果为准，距离肿瘤边缘3～5 cm处完整切除肿瘤病灶，对毗邻的血管神经束应一同切除。术后对瘤段标本边缘进行病理评估，若不到安全边缘则再次切除骨骺。②移植骨段处理。术前30 min从骨库中取出相应骨段，室温下复温并用75%酒精冲洗，剔除多余软组织。安装髓内固定装置后用酒精冲洗肉眼可见松质骨部位，用3%过氧化氢冲洗髓腔、松质骨，最后用抗生素溶液冲洗。③骨重建。采用逆行髓内钉固定移植的大段同种异体骨，适当扩大骨髓腔。骨骺采用松质骨拉力螺钉与截骨面垂体固定，在异体骨与自体骨界河部植入自体松质骨粒。术后石膏固定肢体功能位6周，逐步开展功能锻炼。

观察组患者在保肢手术治疗同时，加入新辅助化疗，以4周为1个化疗周期，术前进行2周期化疗，术后继续化疗4～6周期，具体如下：甲氨蝶呤（悦康药业集团有限公司，国药准字H20113120）10 g/m2，静脉滴注，4～6 h，持续7 d；四氢叶酸（武汉世宏科贸有限责任公司）15 mg/m2，静脉滴注，间隔6 h使用1次，持续3 d；第3周开始予以异环磷酰胺（海南锦瑞制药股份有限公司，国药准字H20113420）2 g/m2，静脉滴注，持续5 d；阿霉素（广东岭南制药有限公司，国药准字 H20063155）30 mg/m2，静脉滴注，持续 3 d。

1.3 观察指标

1.3.1 组织 microRNA 表达 术中留取肿瘤组织标本，采用RT-PCR法检测目标基因表达。根据microRNA Isolation Kit说明书提取总 RNA，采用逆转录试剂盒（美国Sigma公司）合成cDNA，采用Taq Man microRNA Assay Kit检测样本中 microRNA-145、microRNA-101、microRNA-335、microRNA-365表达。反应条件 ：95℃预变性 10 min，95℃变性 15 s，60℃延伸 60 s，70℃退火 1 s，共计 40 个循环。反应后得到基本循环数（Ct值）并根据公式计算目的基因表达量，设置对照组患者的上述基因microRNA表达量为100，计算观察组患者的相应基因microRNA表达量。

1.3.2 血清肿瘤标志物 术后 4 周，抽取两组患者的空腹、外周静脉血2 ml，室温静置后4℃下低速离心取上清液，采用全自动生化分析仪（南京普朗医用设备有限公司）测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）含量，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）含量。

1.3.3 远期预后 术后对两组患者进行长期随访，记录无进展生存时间（progression free survival time,PFS）、总生存时间（overall survival,OS）及 5 年生存率。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，绘制生存曲线，采用Log-rank法比较两组5年生存率，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织microRNA表达比较

观察组患者的术中肿瘤标本组织中microRNA-145、microRNA-101、microRNA-335、microRNA-365表达与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组高于对照组患者。见表1。

2.2 血清肿瘤标志物比较

术后4周，观察组患者血清中肿瘤标志物ALP、LDH、VEGF、bFGF的含量与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组低于对照组患者。见表2。

表1 术中肿瘤组织microRNA表达量比较 （n=39，±s）

表1 术中肿瘤组织microRNA表达量比较 （n=39，±s）

组别 microRNA-145 microRNA-101 microRNA-335 microRNA-365观察组 172.81±20.95 154.36±18.74 159.37±17.88 164.38±17.95对照组 100.00±10.72 100.00±11.63 100.00±10.74 100.00±11.62 t值 7.283 6.182 6.094 7.172 P值 0.011 0.023 0.027 0.015

表2 治疗后血清肿瘤标志物含量比较 （n=39，±s）

表2 治疗后血清肿瘤标志物含量比较 （n=39，±s）

组别 ALP/（IU/L） LDH/（IU/L） VEGF/（pg/ml） bFGF/（pg/ml）观察组 73.27±8.12 89.26±9.12 283.91±30.18 163.29±20.85对照组 124.08±14.53 134.59±16.82 494.72±50.85 351.74±40.86 t值 7.293 8.192 11.273 13.872 P值 0.018 0.012 0.000 0.000

2.3 远期预后比较

随访期间，观察组患者的PFS、OS时间分别为与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组时间长于对照组。生存曲线见附图所示，观察组患者的5年生存率与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=8.265，P=0.004），观察组高于对照组。见表3。

表3 两组患者的治疗后远期预后比较（n=39，年，±s）

表3 两组患者的治疗后远期预后比较（n=39，年，±s）

组别 PFS OS观察组 3.42±0.45 6.23±0.71对照组 2.06±0.23 4.51±0.58 t值 5.283 6.091 P值 0.027 0.021

附图 两组患者的生存曲线

3 讨论

新辅助化疗是目前临床应用较多的早期肿瘤手术切除前化疗方案，旨在增加手术肿瘤切除彻底性、减少术后肿瘤复发率[5]。目前新辅助化疗在胃癌、肺癌、结直肠癌等肿瘤性疾病中已经获得成功应用[6]。早期骨肉瘤患者以手术切除骨肿瘤组织为主要方法，骨肉瘤病灶边缘无法有效切除时多采取截肢治疗，故目前有学者提出将新辅助化疗加入骨肉瘤手术治疗中，以期提高患者的保肢手术成功率。

有研究认为，新辅助化疗是保肢手术的关键环节，本研究根据骨肉瘤特性选择甲氨蝶呤、四氢叶酸、异环磷酰胺、阿霉素等敏感性药物组成化疗方案，完成术前2个周期化疗，对照组患者术前未作特殊处理，术中留取两组患者的肿瘤组织标本并检测相关恶性分子表达量。近年研究发现，microRNA通过与靶mRNA 3'-端互补结合，实现对靶基因的表达调控作用，直接参与细胞的增殖分化、凋亡过程[7-8]。microRNA-145在较多研究中被发现可有效抑制骨肉瘤细胞增殖、促进其凋亡；microRNA-101被发现低表达于骨肉瘤MG-63细胞中，与肿瘤增殖转移相关[9]。王勇等[10]研究指出，microRNA-335可通过靶向Spl基因抑制骨肿瘤细胞增殖；高金鉴等[11]研究明确，microRNA-365可以抑制骨肉瘤SOSP9607细胞增殖，通过调节KRAS发挥抑癌作用。本研究对肿瘤组织中的上述microRNA表达进行检测，结果发现：与对照组患者比较，观察组患者的术中肿瘤组织microRNA-145、microRNA-101、microRNA-335、microRNA-365表达均较高，说明新辅助化疗可以有效激活抑癌基因的表达，积极杀灭骨肉瘤微小转移灶及肿瘤细胞活性，为手术中肿瘤组织的完整切除奠定基础。

新辅助化疗贯穿围术期，本次研究观察组患者术后继续接受4～6个周期的化疗。血清骨肉瘤恶性程度相关指标的表达量变化可以实时反映肿瘤进展情况，也是手术治疗效果的间接衡量手段。ALP是公认与骨肉瘤发生密切相关的因子，当组织癌变发生时ALP大量分泌，其含量也可以很好地反映骨肿瘤治疗预后[12-13]。LDH是机体糖酵解的限速酶，可以反映肿瘤组织代谢速率，国内外较多文献均报道，恶性肿瘤组织中存在LDH及其同工酶含量的上升。VEGF、bFGF均参与恶性肿瘤的发生、发展，VEGF具有强大的促血管生成作用，已经被发现高表达于绝大多数恶性肿瘤细胞中；bFGF属于血管生成正性调控因子，对肿瘤细胞生长及血管形成均具有促进作用[14-15]。术后4周，本研究对上述肿瘤相关因子含量进行检测并发现，于对照组患者比较，观察组患者的血清ALP、LDH、VEGF、bFGF含量均较低，提示术前新辅助化疗可以有效降低骨肉瘤患者的术后肿瘤恶性程度，证实联合治疗在优化近期疗效方面的卓越效果。

以往骨肉瘤保肢手术患者的5年生存率并不高，这也成为保肢治疗在临床无法普及、患者术后生存质量严重降低的主要原因之一[16]。本研究在术后对两组患者进行长期随访，结果发现：观察组患者的PFS时间长于对照组，整体生存率高于对照组患者，也进一步证实了新辅助化疗联合保肢手术在优化骨肉瘤患者远期预后方面的肯定作用。

综上所述，得出以下结论：新辅助化疗联合保肢手术可抑制骨肉瘤组织恶性分子表达、增强手术治疗效果，优化远期治疗结局