F11 rs2289252基因多态性与急性白血病患者出血相关性分析

董 娟 陈永玲 邹惠安 李 滔 梅 冰

急性白血病(Acute Leukemia，AL)是一种恶性血液系统疾病，常见的临床表现有瘀斑、牙龈出血、鼻出血等。AL患者中凝血及血栓性问题危及患者生命，故对患者出血的预防及预测尤为重要。凝血因子Ⅺ(F11)基因定位于4号染色体，编码凝血因子Ⅺ，F11在凝血级联反应中具有重要作用。研究发现F11 rs2289252多态性与血浆F11水平相关[1]。F11 rs2289252在AL中表达如何，目前尚未见报道。本研究检测分析了AL 患者[急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)]和健康对照者rs2289252 基因位点单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，探讨rs2289252基因多态性与AL患者出血之间的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2016-09—2018-09在荆州市中心医院确诊AL患者90例，其中AML患者70例(AML组，男37例，女33例，年龄41.34±15.01岁)，ALL患者20例(ALL组，男10例，女10例，年龄42.17±15.32岁)。所有患者均经骨髓细胞形态学、免疫学分型、流式细胞学检测，符合《血液病诊断及疗效标准》[2]。根据入院时有无出血症状将AML和ALL患者分为出血组(表现为皮肤瘀点瘀斑、牙龈出血、鼻腔出血、眼底出血、尿红细胞阳性、粪隐血试验阳性、肉眼血尿、黑便、颅内出血等)和未出血组两个亚组。选取同期体检健康者104例作为对照组，男59例，女45例，平均年龄42.95±15.23岁。所有受试者确诊前均未服用影响凝血及血液系统的药物，无肝、肾疾病史、感染性疾病史及家族血栓病史。AML组、ALL组与对照组间性别、年龄差异均无统计学意义(χ2=0.308，F=0.288，P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要设备和耗材

XN-3000型全自动血液分析仪(日本Sysmex公司)、ACL-TOP型全自动凝血分析仪(美国IL公司)、东胜龙ETC 811 PCR仪(北京东胜创新生物科技公司)；JY3000电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)；BioDoc-it凝胶成像系统(美国UVP公司) ；超微量核酸分析仪(英国BioDrop公司)；TaKaRa Ex Taq PCR反应试剂盒(大连宝生物工程公司)；QIAamp DNA Blood Mini Kit核酸提取纯化试剂盒(德国QIAGEN公司)，Gel Red核酸染料(美国Biotium公司)，DL 1000 DNA Marker(大连宝生物工程公司)，其它试剂均为厂家配套试剂。

1.3 引物合成

根据NCBI提供的F11 rs2289252位点前后约250bp序列，利用primer 5软件在线设计引物，上游引物：5’-ACT TAT TTT GGG AAT GTG GGT-3’，下游引物：5’-GGT TCC GCT CTT CAT TTC TAG-3’，扩增片段大小为569bp，由上海生工生物公司合成。

1.4 检测方法

所有受试者均在清晨空腹采集静脉血1.8ml置于含有109mmol/L枸橼酸钠抗凝真空管中，充分颠倒混匀、离心，全自动凝血分析仪检测凝血指标，包括纤维蛋白原(FIB)、血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT)。同时，采集所有受试者静脉血2ml置于含EDTA-K2抗凝剂的抗凝管中，充分混匀，取200μl置于1.5ml EP管中，用QIAGEN公司提供的核酸提取纯化试剂盒提取基因组DNA，提取方法按试剂说明书进行，测定提取后DNA的浓度和纯度，于-80℃保存。剩余全血采用全自动血液分析仪完成血常规的检测，包括白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)和血小板计数(PLT)。

1.5 PCR扩增及基因多态性检测

rs2289252位点PCR反应体系为25μl，包含10×Ex Taq Buffer 2.5μl，dNTP Mixture 2μl，Taq酶0.125μl，上游引物(20μmol/L)0.625μl，下游引物(20μmol/L)0.625μl，灭菌蒸馏水17.125μl，DNA模板2μl(约100ng)；rs2289252位点扩增条件为：95℃ 30s；95℃ 10s，58.8℃ 30s，72℃ 45s，循环30次。取5μl PCR扩增产物用含Gel Red核酸染料的2%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物特异性，剩余PCR扩增产物送上海生工生物公司进行测序。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组血常规、凝血指标水平比较

各组WBC、RBC、Hb、PLT、FIB水平差异有统计学意义。与对照组比较，AML组和ALL组WBC和FIB 水平均升高，RBC、Hb、PLT水平均降低，且AML组各指标异常更明显，差异均有统计学意义(t均>3.363，P均<0.01)。各组PT、APTT、TT水平差异无统计学意义。见表1。

表1 各组血常规、凝血指标比较

2.2 F11 rs2289252位点多态性分布

采用Sanger法检测F11 rs2289252多态性位点基因型，测序图谱见图1。基因型频率符合Hardy-Wenberg平衡，样本具有群体代表性。各组rs2289252位点CC、TC、TT基因型差异无统计学意义(P>0.05)。各组rs2289252等位基因频率在间差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图1 F11 rs2289252位点的测序图谱

表2 AML组、ALL组及对照组 rs2289252位点基因型及等位基因频率的比较(n，%)

2.3 出血与未出血AL患者F11 rs2289252位点基因多态性

AML患者中，出血组与未出血组患者rs2289252位点基因型和等位基因频率差异均有统计学意义(P<0.05)，出血组CC基因型频率高于未出血组，TT、TC基因型频率低于未出血组(P<0.05)；出血组T等位基因频率低于未出血组(P<0.05)。ALL患者中，出血组与未出血组患者rs2289252位点基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 未出血患者与出血患者基因型和等位基因频率的比较(n，%)

2.4 AML患者出血与rs2289252位点基因多态性多元Logistic回归分析

通过排除性别、年龄、PLT等干扰因素的多元Logistic回归分析rs2289252位点与AML患者出血易感性，结果显示，rs2289252 TC基因型患者出血的风险是CC型的0.256倍，见表4。

表4 F11 rs2289252基因型与AML患者出血风险的关联

3 讨 论

皮肤瘀斑或出血是AL患者常见的临床症状。AL与止血系统有关，部分患者临床表现为出血，少数患者也有静脉血栓(VTE)、肺栓塞(PE)、弥散性血管内凝血(DIC)等表现，也可有出血和血栓并发症的危险。WBC增加与FIB降解产物增多是初发AL早期颅内出血的危险因素[3]。研究表明PLT减少使患者有更高的出血风险[4]。对本研究对象一般资料比较表明，AML组和ALL组WBC、FIB水平较对照组明显升高，RBC、Hb、PLT水平明显降低。血液病患者由于伴随PLT减少而具有非常高的出血性风险。传统的凝血试验如PLT、PT、FIB、APTT、TT等对患者凝血功能的判断仍有局限性[5]。因此，从遗传学角度预估AL患者出血风险对临床治疗至关重要。

F11的凝血功能既可以通过组织因子途径抑制物(TFPI)的失活促进凝血酶生成，也可以通过凝血酶反馈激活F11进一步放大外源性凝血途径[6]。F11最初被描述为接触激活通路的一个成员，与凝血因子7、组织因子一起导致凝血酶产生，随后在血管损伤时形成血栓。本研究通过分析各组F11 rs2289252基因多态性结果表明，各组rs2289252位点CC、TC、TT基因型差异无统计学意义(P>0.05)。各组rs2289252等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05)。有研究发现F11 rs2289252与妊娠晚期静脉血栓形成相关[7]。拉脱维亚人群中，F11 rs2289252多态性是深静脉血栓形成的重要遗传学标记，可评估和预防深静脉血栓的风险[8]。有研究对位于CYP4V2基因附近F11基因进行了基因分型，确定了F11基因的rs2289252与深静脉血栓有关联[9-10]。这些研究为F11在血栓形成过程中的作用提供了支持，并且F11缺乏症患者会有轻度出血表现，F11作为抗凝治疗的潜在靶点，可能降低出血的风险，近年来受到了广泛的关注[11]。目前F11被认为在产生持续凝血酶和稳定血栓形成方面起着重要的作用。基于F11在凝血功能中的作用，F11编码基因的多态性可能与AL患者出血的发生发展相关。AML患者中，出血组与未出血组患者rs2289252位点基因型和等位基因频率差异均有统计学意义(P<0.05)，出血组CC基因型频率高于未出血组，TT、TC基因型频率低于未出血组(P<0.05)；出血组T等位基因频率低于未出血组(P<0.05)。ALL患者中，出血组与未出血组患者rs2289252位点基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。

目前，越来越多的研究集中在SNP上[12]。El-Galaly等人复制全基因组关联研究结果后，发现rs2289252 TT基因型与静脉血栓栓塞的风险显著相关[7]。有Meta分析显示， F11 rs2289252 TT基因型是共同显性模型VTE易感性的危险因素[13]。血栓与出血的发生与凝血因子的产生及活性紊乱相关，受相关遗传因素的影响。研究发现rs2289252 T等位基因是F11活性较高的预测因子[14]。本研究通过Sanger测序法检测F11 rs2289252 位点基因型发现AML组未出血组 rs2234237 位点的 T 等位基因频率高于出血组(44.68% vs 26.09%，P=0.034)，提示rs2234237位点的多态性改变可能与AML出血发生有关；ALL组F11 rs2289252位点等位基因频率在未出血组与出血组间的差异无统计学意义(P>0.05)。通过排除性别、年龄、PLT等干扰因素的多元Logistic回归方法分析rs2289252位点的多态性对AML出血风险评估后发现，TC基因型与AML患者出血风险呈负相关，F11 rs2289252 T等位基因可能是AML患者出血保护因素。

遗传因素有着显著的地域及种族差异，本研究收集的病人均来自荆州地区汉族人群，样本量较少，因此，下一步还需加大样本量，以进一步明确凝血相关基因多态性与AL患者出血的关系。