百事乐加味方对卒中后抑郁大鼠海马神经元自噬蛋白的影响

刘羽 刘检 易亚乔 凌佳 刘丽 邵乐 刘林

摘要：目的  觀察百事乐加味方对卒中后抑郁（PSD）大鼠神经功能缺损评分、形态学改变及海马自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表达的影响，探讨PSD神经元细胞自噬机制及中药防治作用。方法  采用大脑中动脉栓塞+慢性不可预见温和应激+孤养法制作PSD模型，分组前进行行为学评分，随机分为假手术组、抑郁组、卒中组、PSD组、阳性药组、百事乐加味方组，各给药组给予相应药物，连续28 d。HE、Nissl染色观察大鼠海马形态;免疫组化检测PSD大鼠海马mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ的表达。结果  与假手术组比较，PSD组大鼠神经功能缺损评分明显升高，海马mTOR表达明显降低，Beclin-1、LC-3Ⅱ表达明显升高（P<0.01）;与PSD组比较，百事乐加味方组大鼠功能缺损评分显著降低，海马组织病理形态明显改善，海马mTOR蛋白表达明显升高，Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论  百事乐加味方可有效改善PSD大鼠行为学、病理学表现，抑制神经细胞异常自噬可能是其抗PSD的重要机制之一。

关键词：百事乐加味方;卒中后抑郁;海马;自噬;脑缺血;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）02-0052-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.012

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Abstract： Objective To observe the effects of modified Baishile Formula on the neurological deficit score and the expressions of mTOR， Beclin-1 and LC-3Ⅱ in hippocampus of post-stroke depression （PSD） rats; To explore the preventive and therapeutic mechanism of TCM for post-stroke depression from neuronal autophagy. Methods The rat model of focal cerebral ischemia was established by the method of middle cerebral artery occlusion （MCAO）， and the PSD model was established by combining with chronic unpredictable mild stress （CUMS） and solitary nourishment. The behavioral scores were evaluated by Longa grading method before dividing the groups. The rats were randomly divided into sham-operation group， depression group， post-stroke group， PSD group， positive medicine group and modified Baishile Formula group. Each administration group was given relevant medicine for 28 d. The morphological changes of hippocampus were observed by HE staining and Nissl staining. Immunohistochemical method was used to detect the expressions of mTOR， Beclin-1 and LC-3Ⅱ in hippocampus of PSD rats. Results Compared with the sham-operation group， the neurological deficit score of the PSD group significantly increased， the expression of mTOR in the hippocampus significantly decreased， and the expressions of Beclin-1 and LC-3Ⅱ significantly increased （P<0.01）. Compared with the PSD group， the neurological deficit score of the rats in modified Baishile Formula groupsignificantly decreased， the pathological morphology of the hippocampus wassignificantly improved， the expression of mTOR protein in the hippocampus significantly increased， and the expression of Beclin-1 and LC-3Ⅱ proteins significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Modified Baishile Formula can effectively improve the behavioral and pathological symptoms of PSD rats and inhibit autonomic phagocytosis. It may be one of the important mechanisms of treating PSD.

Keywords： modified Baishile Formula; post-stroke depression; hippocampus; autophagy; cerebral ischemia; rats

自噬是机体在缺血、缺氧等状态下发生的一种应激反应，在脑血管、神经功能疾病中占有至关重要的地位，是防治卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）的潜在机制之一。百事乐加味方是“百事乐”（专利号ZL20101010856.X）为基础加味而成，具有活血疏肝、解郁通络、养心安神、健脾化痰功效，临床常用于肝气郁结、痰瘀阻络证患者，其有抗PSD及改善神经功能作用^[1-2]，但其作用机制有待进一步深入探讨。因此，本研究采用形态学和免疫组化方法观察百事乐加味方对PSD大鼠海马病理形态改变和自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表达的影响，从海马神经细胞自噬方面探讨复方中药防治PSD可能的作用机制，为临床应用提供依据。

1  实验材料

1.1  药物

百事乐加味方（柴胡、姜黄、人参等），饮片由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供;盐酸氟西汀片，礼来苏州制药有限公司，20 mg/片，批号3435A;阿司匹林片，舒泰神生物制药股份有限公司，50 mg/片，批号170803。

1.2  动物

SD大鼠80只，SPF级，雄性，体质量（200±20）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级动物实验室，温度18～22 ℃、相对湿度40%～50%，自由摄食饮水。

1.3  主要试剂与仪器

山羊抗兔/小鼠IgG、DAB显色液，中杉金桥生物试剂公司;甲苯胺兰，上海试剂三厂;mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ一抗，Bioss公司;多聚甲醛，天津市科密欧化学试剂有限公司;水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司。TDZ4-WS离心机（湖南湘仪），血液混匀仪（北京宏润达），AUW2200分析天平（日本岛津），BC51显微镜（日本奥林巴斯）。

2  实验方法

2.1  造模

参照改良Koizumi法^[1]制作局灶性脑缺血大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉;颈部正中切口，钝性分离右颈总动脉（CCA）主干、CCA分叉、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）;相继结扎CCA主干和ECA近心端，在CCA主干远端及ICA根部穿线备用;用微动脉夹暂时夹闭ICA远端;在距CCA分叉部3～4 mm处用眼科剪剪一小口，插入线栓，使线栓从CCA顺行进入ICA，松开ICA的微动脉夹，使线栓略呈弧形，向外上方的角度缓慢顺着ICA走向插入，防止误插入翼腭动脉（PPA）。若只插进约10 mm就有明显阻力则提示误插，此时可缓慢退出后调整方向再插，直到阻力感较明显时停止插入，此时插入深度为18～20 mm（从CCA分叉处计算），说明线栓到达大脑中动脉（MCA）起始段，将阻断进入MCA的血流，引起局灶性脑缺血改变。结扎CCA主干远端及ICA根部备线，防止线栓脱落，剪断多出的栓线;生理盐水清洗，消毒棉球清洁手术野，逐层缝合。注射用青霉素钠盐4万U/只腹腔注射，预防术后感染^[2-3]。手术大鼠单笼孤养，术后恢复7 d后，再给予28 d慢性不可预见温和应激（CUMS），包括禁食、禁水、行为限制、潮湿垫料、昼夜颠倒、倾笼、夹尾7种刺激方法，每种方法使用4次，随机分布于4个应激周期中，制作PSD模型。

2.2  分組

大鼠在预养期间进行蔗糖水消耗训练实验和旷场实验行为评分，测定蔗糖水消耗实验和旷场实验的基线值，从中筛选出行为评分均一的大鼠，随机分为假手术组、抑郁组、卒中组、PSD组、阳性药组、百事乐加味方组（中药组）。随机补充手术后死亡的大鼠和应激过程及实验过程中不可预料因素致死的大鼠，使每组最终达到8只。假手术组：给予假手术处理，除栓线不插入颈总动脉外，其余操作同卒中组。采用线栓法制备局灶性脑缺血MCAO模型，选择术后神经功能缺损评分>1分且<4分大鼠入组，每笼4只饲养;抑郁组：CUMS结合孤养法制备慢性应激抑郁模型;PSD组：MCAO模型大鼠术后恢复7 d后加以孤养法结合CUMS法。

2.3  给药

除假手术组与卒中组外，其余各组大鼠应激造模28 d，各组均于应激造模同时给药，阳性药组大鼠灌胃给予氟西汀（0.005 4g/kg）+阿司匹林（0.27 g/kg），中药组大鼠给予百事乐加味方煎液（23.5 g/kg）灌胃，假手术组、卒中组、抑郁组、PSD组大鼠均灌胃蒸馏水。给药体积均为10 mL/kg，连续28 d。

2.4  指标检测

2.4.1  神经功能缺损评分

分别于MCAO造模分组及应激后每周按照Longa分级法^[4]进行行为学评分：0分为无缺陷;1分为不能伸展对侧前肢;2分为对侧前肢屈曲;3分为轻度向对侧转圈;4分为严重向对侧转圈;5分为向对侧跌倒进行。观察各组神经功能缺损评分情况。

2.4.2  海马组织神经细胞形态观察

灌胃给药28 d后，取材前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，腹主动脉采血处死，迅速4%多聚甲醛从心脏灌注固定，取大脑海马组织经脱水、透明、浸蜡与包埋，将蜡块常规切片，HE、Nissl染色观察形态学变化。

2.4.3  海马自噬相关蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ检测

大鼠处死后，4%多聚甲醛固定，取大鼠海马组织，经脱水、透明、浸蜡与包埋，切片，免疫组化检测大鼠细胞凋亡因子mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ表达。

3  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较用t检验，多组均数比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  神经功能缺损评分结果

与假手术组比较，PSD组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P<0.01）;与PSD组比较，中药组大鼠神经功能评分明显降低（P<0.01）。

4.2  百事乐加味方对模型大鼠海马病理形态的影响

海马组织形态观察显示，PSD组大鼠海马组织细胞结构模糊，核固缩，坏死灶边缘可见炎性细胞浸润等不同程度的病理损害;经药物治疗后，与PSD组比较，中药组神经元细胞形态、变性、坏死等病理学改变明显改善。

4.3  百事乐加味方对大鼠海马组织自噬蛋白mTOR、Beclin-1、LC-3Ⅱ水平的影响

与假手术组比较，PSD组大鼠海马组织mTOR表达水平明显低降，Beclin-1、LC-3Ⅱ表达水平明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）;与PSD组比较，中药组大鼠海马组织mTOR表达水平明显上升，Beclin-1、LC-3Ⅱ表达水平明显下降，差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。

5  讨论

自噬是真核细胞防御和应激调控的生物学机制，具有两面性：一方面，在细胞营养缺乏时，自噬发挥维持细胞能量稳态的重要作用，在发育过程中有利于组织重塑，清除细胞内有害和过剩的细胞器及病原体，起保护作用;另一方面，过度激活可导致细胞程序性死亡，是引起一系列疾病的病理过程。自噬在中枢神经系统中起着重要的作用，尤其是对维持神经元的功能起着重要的作用，脑卒中缺血、缺氧、应激等状态均诱导机体自噬失衡，加重神经组织损伤，自噬调节细胞稳态平衡是神经保护作用重要机制。李丹丹等^[5]研究表明，脑缺血引起的缺血、缺氧等应激条件可诱导自噬发生，形成LC3-Ⅱ复合物，LC3-Ⅱ是自噬形成的标记物。徐爱军等^[6]研究发现，柴胡疏肝散具有显著的抗抑郁作用，其主要作用机制可能与其降低海马LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ比值和Beclin-1蛋白水平，抑制神经元自噬有关。

哺乳动物mTOR是各种形式突触重塑和记忆形成所必不可少的关键激酶，是防治抑郁症新的重要靶点。mTOR是神经元细胞生长、发育、成熟及功能正常运转的重要蛋白。mTOR通路抗抑郁研究表明，激活mTOR信號可有利于抑郁症突触重塑^[7];PI3K/mTOR/CREB通路活化在大鼠神经退化，突触和神经传递功能障碍，抗氧化应激方面具有保护作用^[8];药物可通过PI3K/Akt/mTOR通路上调皮质甾酮诱导小鼠抑郁模型海马mTOR、PSD95及脑源性神经营养因子表达，从而产生抗抑郁作用^[9];或上调mTOR信号通路，调节海马突触重塑并缓解抑郁症状^[10]。

mTOR-自噬通路是脑神经分子网络的一条重要的调控轴，mTOR-自噬调控失衡是抑郁症的主要发病机制^[11]。mTOR介导自噬信号通路调控神经分子网络可能是PSD突触重塑新机制。已有研究报道，mTOR/自噬调控信号通路在肿瘤、糖尿病、心脑血管等疾病中起重要作用，尤其在脑血管并发神经性疾病^[12-14]。mTOR是调控自噬的关键信号分子，mTOR/自噬调节平衡是神经元细胞存活、突触重塑的重要因素。在脑缺血缺氧（脑卒中）损伤及应激等状态均可以激发mTOR/自噬信号调控的失衡，激活自噬是抑郁症的主要发病机制^[9];在缺血再灌注大鼠模型中，间歇性缺氧激活mTOR/自噬通路，增加细胞自噬，加重神经细胞损伤^[15]。抗抑郁药物氟西汀能通过调节mTOR-自噬通路激活mTOR，抑制自噬缓解抑郁症状，改善抑郁大鼠模型海马突触重塑^[10]。有研究报道，N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体参与神经元细胞自噬过程，通过激活诱发神经元细胞自噬进而凋亡，产生抑郁，抑制NMDA受体可激活mTOR通路，抑制自噬，保护神经元突触可塑性^[16-17];NMDA通过AKT/mTOR介导自噬在其他疾病研究已有报道，目前在PSD中尚未见报道^[18]。

PSD在中医里未见明确记载，其属情志疾病中“郁症”与“中风”之合病，痰瘀互结为主要致病因素，情志不舒、气机郁滞，气不布津，聚而成痰，痰湿上扰，蒙蔽清窍，元神失用而致PSD。百事乐加味方中姜黄活血化瘀、行气止痛，善破肝脾二经之血瘀气结，主血瘀气滞诸症，现代药理研究表明，姜黄有效成分姜黄素可通过PI3K/Akt/mTOR信号调节细胞自噬^[19];人参大补元气、安神益智、解郁化痰，其有效成分人参皂苷Rg1可通过抑制海马神经元异常自噬，从而改善大鼠行为学和神经突触重塑^[20]。本实验结果表明，PSD模型大鼠海马组织mTOR蛋白表达下调、Beclin-1、LC-3Ⅱ表达上调，提示自噬异常活化是PSD病理机制之一。百事乐加味方干预治疗，能有效降低自噬相关蛋白表达水平，抑制异常自噬，改善海马病理形态，提高神经功能。据此推测，mTOR介导自噬调控失衡，相关神经系统分子网络功能异常，从而影响海马突触重塑障碍可能是PSD的重要机制。但百事乐加味方在PSD神经系统分子网络作用机制还有待进一步深入探讨。

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