P27基因参与子痫前期发生机制的研究进展

范卓然，顾艳，华绍芳

子痫前期（pre-eclampsia，PE）是妊娠期特发疾病，是导致母体、胎儿和新生儿患病率与死亡率增加的重要原因。尽管PE的确切发病机制尚不明确，但发生于孕34周前的早发型子痫前期（early onset preeclampsia，EOPE）与滋养细胞侵入障碍、胎盘缺氧关系密切，并增加胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）风险[1]。胎盘是具有转运、分泌、防御等多种功能的重要胎儿附属物，其形成及功能发挥取决于滋养细胞正常的增殖、凋亡、分化与侵入过程[2]。P27基因作为周期蛋白/周期蛋白激酶抑制蛋白（CiP/kiP）家族重要成员参与细胞周期的正常进展[3]。现就P27基因与PE发生机制的相关性研究进行综述。

1 P27基因与细胞周期

真核细胞周期的正常进展需要细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）配合cyclin促进细胞增殖，并依靠细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）进行调节。CKIs常与 Cyclin、CDKs或Cyclin/CDK复合体结合阻止CDKs的活动，CKIs按其结构与功能分为CDK4抑制剂（Ink4）家族与CiP/kiP家族，P27基因则属于CiP/kiP家族[4]。P27基因定位于第12号染色体上，常与Cyclin/CDK结合阻止细胞周期由G1期向S期转变，CDK2是P27蛋白的主要结合目标，P27基因的表达在G0和G1早期较丰富，其与CyclinE/CDK2结合并阻止其活性。在P27蛋白的氨基端有与Cyclin/CDK结合的激酶抑制结构域，由Cyclin结合区和激酶结合区组成，P27蛋白通过激酶结合区与CDK2结合，通过Cyclin结合区与CyclinE相互作用[5]。作为一种抑癌基因，P27阻止细胞周期进展的作用已有报道，而近年又有研究显示P27对细胞分化、凋亡与迁移也有重要影响，并在一定条件下可能发挥促进细胞增殖或抑制细胞增殖的作用[6]。

2 PE患者胎盘P27表达

细胞周期调节因子可能通过调控滋养细胞增殖与分化而在PE患者胎盘病理中发挥重要作用，PE患者胎盘滋养细胞存在异常增殖及凋亡增多[7]。细胞周期调节因子如何协调滋养细胞的增殖与分化，影响其增殖与分化的因素有哪些，以及PE患者改变滋养细胞生长的机制都尚不明确，因此了解细胞周期因子在病理性胎盘中的作用尤为重要。

Unek等[8]研究发现，与正常妊娠对照组相比，PE患者胎盘组织存在更为显著的钙化、合体细胞结节、绒毛间与绒毛内纤维素样沉积等病理改变；在胎盘基板上，纤维素样沉积、坏死部位更多见。P27基因在胎盘绒毛细胞滋养细胞、合体细胞-吞噬细胞、绒毛间质细胞、绒毛外滋养细胞、羊膜上皮及绒毛膜间质细胞中的表达、染色强度均明显增加，在细胞外滋养细胞中增加更加明显。其增加可能与绒毛外滋养细胞的侵入减少有关，这可能也是PE患者胎盘早剥发生率比正常孕妇高3倍的重要原因[9]。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及核抗原Ki-67等增殖标志物在PE患者胎盘中显著减少，细胞周期抑制因子P27和P57基因的表达明显增加。这一改变可能与侵袭性滋养层细胞凋亡增加有关[9]。

3 P27基因参与PE的发病机制

3.1 P27蛋白、CDK细胞质易位调节细胞增殖P27可在细胞质与细胞核内自由穿梭从而发挥不同作用。正常情况下，G0期P27蛋白只定位于细胞核内并阻止CDK2活性，G1期P27逐渐移至细胞质，细胞进入S期，CyclinE蛋白水平上升，其与CDK2结合并活化，从而导致P27的T187残基磷酸化，使P27变得不稳定并通过泛素-蛋白酶体途径降解，P27失去CKIs的作用，从而使CDK2和CyclinE/A复合体恢复活性并参与DNA复制的启动，P27在G1期很快被水解，在S期时已很少能检测到[10]。转化生长因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）对调节多种类型细胞的增殖与分化至关重要，通过TGF-β的Ⅰ型受体抑制剂抑制TGF-β的信号转导，发现P27的不稳定性增加，有研究发现，TGF-β可促进P27的细胞质易位，在肿瘤细胞胞质中的P27可能发挥致癌作用[11]。作为TGF-β超家族成员，Nodal信号通路与P27基因的表达关系密切。激活素受体样激酶 7（activin receptor-like kinase，ALK7）是TGF-β的Ⅰ型受体。有研究显示，Nodal过表达或ALK7上调增加P27 mRNA在滋养细胞中的水平[12]。另外，转染重组Nodal（rNodal）或ALK7的滋养细胞P27蛋白水平较未转染组也有增高，且蛋白质的存在时间也较未转染组明显延长，说明Nodal影响P27蛋白的稳定性[12]。在用编码Nodal前体（N53）或成熟Nodal（N56）的质粒转染的滋养细胞中，P27主要存在于细胞质，而正常滋养细胞P27几乎全部限制于细胞核内。P27常与CDK2形成复合物以阻断G1/S期进程来阻止细胞增殖[13]，而Nodal未转染组CDK2检测其位于细胞核，转染组则可在细胞质中检测到，说明Nodal/ALK7诱导P27和CDK2的细胞质易位，且细胞质中的P27仍保留细胞周期抑制功能[12]。在rNodal转染组，P27被运输到细胞质，但并没有导致S期的进展或P27蛋白的降解。相反，rNodal诱导的细胞的细胞质中有P27的积累，且将细胞阻滞于G1期，减少细胞增殖。Nodal有两型受体，即ALK4和ALK7。TGF激活ALK5使激活素A（Activin-A）与ALK4结合，促使转录激活因子Smad2/3磷酸化[14]。将滋养细胞分别转染Activin-A、rNodal及活性ALK7或 ALK5、ALK4 后发现，rNodal、TGF-β1、活性 ALK7或ALK5可使P27蛋白和CDK2细胞质易位增加，而Activin-A、ALK4无此作用，这些结果表明，P27和CDK2的细胞质易位可能是生长因子抑制滋养细胞增殖和细胞迁移的共同特征[12]。P27的功能主要是通过翻译后修饰来调节，如磷酸化，其决定蛋白质的稳定性和亚细胞定位，及在细胞核与细胞质中积累的复杂过程[13]。P27基因细胞核的表达被证明可调控细胞周期，在大多数肿瘤细胞中，P27在细胞质中被磷酸化降解，细胞质中的P27不能发挥其作为CKIs的功能，而Nodal可增加P27的细胞质易位并保留其功能[15]。

研究显示P27基因的T198、T157、S10磷酸化可能与引起P27细胞质滞留有关。P27的核定位序列（nuclear location sequence，NLS）包含 Thr157、Thr178残基，通过蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）对T157、T178残基的磷酸化导致P27蛋白的细胞质易位，加强P27与14-3-3伴侣蛋白的结合作用，维持胞质中的P27蛋白含量，当细胞进入G1期，P27-S10残基的磷酸化就成为将P27从细胞核输出至细胞质的强而活跃的信号[16]。S10残基磷酸化后的P27通过包括CDK5、激酶相关蛋白等与染色体区域维持因子 1（chromosome region maintenance factor 1，CRM1）结合来刺激P27的核出口[17]。在正常滋养细胞中，磷酸化P27-S10只局限于细胞核内。向转染及未转染rNodal的滋养细胞中加入野生型P27（P27WT）、P27非磷酸化突变体（P27-S10A）及P27磷酸化模拟突变体（P27-S10D）后发现Nodal诱导了P27WT的细胞质易位，而在细胞质中也检测到P27-S10D的存在，P27-S10A则主要局限于细胞核内[12]。在未转染rNodal的滋养细胞细胞质中也检测到P27-S10D的存在，由此证明P27在S10残基的磷酸化是Nodal调节其细胞质易位所必需的蛋白修饰[17]。Nodal诱导的P27基因的表达增加及P27/CDK2的细胞质易位表明P27在Nodal介导的细胞周期阻滞中发挥重要作用。

另外，P27也是Nodal调节细胞迁移和侵袭的关键介质。细胞质中的P27与不同蛋白质结合可发挥促进或抑制细胞迁移的作用。如P27与微管不稳定蛋白（Stathmin）结合可阻止细胞迁移[18]，而与G蛋白超家族成员RhoA结合则促进细胞迁移[19]。Stathmin是一种细胞结构蛋白，有特有的解聚活性，其高表达与肿瘤的分化、浸润、转移有关，CDK2/CDK5及磷酸化Stathmin可降低微管不稳定活性[20]。P27蛋白在T198位的磷酸化增加了P27的细胞质易位，使P27蛋白与RhoA的结合能力增强[19]。有研究发现Nodal阻滞P27的T198磷酸化，且促进P27蛋白与Stathmin相互作用[12]。Nodal可增加 P27与 CDK2、CyclinE、CDK5和Stathmin的关系及Stathmin在S25和S38的磷酸化，且这种效应在CDK2/CDK5抑制剂存在的条件下减弱；Nodal信号也可能触发P27蛋白和CDK2的输出，导致P27/CDK2/CDK5/Stathmin的结合，从而使Stathmin过磷酸化和失活，导致微管蛋白稳定，从而减少细胞迁移和侵袭[12，18]。这些证据表明Nodal有通过调节微管稳定性抑制滋养层细胞的可能性，其阻滞滋养细胞增殖与侵入的机制可能与P27不同部位的磷酸化及其与不同蛋白质结合有关。

3.2 调节P27蛋白的降解影响细胞增殖内质网应激可通过P27基因的表达抑制细胞增殖。许多细胞应激状态（如缺氧、糖基化状态改变、钙离子流异常等）均可导致内质网应激，这是由一系列的未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）介导的信号传导通路[21]。在哺乳动物细胞中，UPR增加了内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、葡萄糖调节蛋白94（GRP94）及转录因子CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）的表达，UPR与内质网分子伴侣协同阻滞了G1期细胞周期进展及蛋白质的合成[22]。Han等[22]在黑色素瘤细胞中发现P27基因在介导内质网应激引起的G1期细胞阻滞中发挥关键作用。P27蛋白降解需要依赖泛素-蛋白酶体途径，泛素连接酶复合体（SCFSKP2）是此降解途径中使蛋白质磷酸化的关键环节，S期激酶相关蛋白2（SKP2）是P27的特异性E3连接酶，有研究证实内质网应激时P27的积累是由于抑制其多泛素化和蛋白酶体依赖性降解而产生的，且SCF-SKP2使P27的T198位残基磷酸化而开启降解过程[23]。在正常细胞中，SKP2水平在G0/G1期最低，S期逐渐增多。SKP2的过表达导致P27的减少，与肿瘤的无限增殖及生存率低有关[22]。尽管SKP2 有包括 P27、P21、c-myc、E2F1 等在内的许多靶点，但内质网应激期间P27是SKP2的特异性靶点[22-23]。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt途径是P27蛋白功能最重要的信号通路，由几种重要成分组成，包括受体酪氨酸激酶（RTK）、PI3K、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）和Akt等组成。一些受体，如RTK、整合素、细胞因子受体和位于细胞表面（跨膜）的G蛋白耦联受体，能够将细胞外信号转移到细胞中，导致PI3K/Akt途径激活。PI3K/Akt信号通路对P27基因的表达有抑制作用，Akt可以直接在T157、T198位残基上磷酸化P27蛋白，从而阻止P27对CDK-2（160）的抑制活性[24]。蛋白O-岩藻糖基转移酶1（proteinO-fucosyltransferase1，poFUT1）通过 PI3K/Akt信号通路增加了滋养细胞中CyclinD、CyclinE的表达，减少P21、P27蛋白水平，促进细胞进入S期[25]。磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB1-4）家族在果糖 6-磷酸（F-6-P）磷酸化为果糖－2，6－二磷酸（F-2，6-BP）的糖酵解调节中起着重要作用。有研究证实，PFKFB3也能通过细胞核，其产物F-2，6-BP 能激活 CDK1。F-2，6-BP 刺激 T187 处P27蛋白的磷酸化，从而导致P27蛋白泛素化和蛋白酶体降解[26]。

4 结语

综上所述，P27蛋白在肿瘤细胞中具有肿瘤抑制因子（在细胞核内）和致肿瘤蛋白（在细胞质内）的双重作用。其功能由P27蛋白的细胞核和细胞质之间的易位调节。P27基因的表达通过与不同因子结合，影响其翻译后修饰及亚细胞定位。而在PE患者滋养细胞中，P27在细胞核与细胞质中的作用，P27如何影响胎盘滋养细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等能力都有待研究。因此，继续揭示P27与PE发生、进展之间的可能相关性，为预防PE的发生，明确其病因、机制及指导进一步治疗具有重要意义。