细胞外囊泡在肝细胞癌诊断及预后判断中的潜在应用价值

曾婉嘉 于广鑫 鲁凤民

肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡率的第三大原因，其主要危险因素包括慢性病毒性肝炎、酗酒及非酒精性脂肪性肝病等。HCC死亡率高的主要原因之一是早期检出率低，大部分患者在确诊时已处于疾病进展期，可选治疗方式少，预后不佳。肝脏超声(US)是最广泛用于肝癌早期筛查的影像学检查，相对于MRI和CT而言，US具有操作难度小、花费较低的优势，但其灵敏度也相对较低。临床上常将血清甲胎蛋白(AFP)水平用作US的辅助手段，可以在不显著降低特异性的前提下，提高监测的灵敏度。除了AFP以外，AFP异质体(AFP-L3%)和异常凝血酶原(DCP)等也在早期HCC筛查和诊断中表现出了较好的应用前景[1]。

近年来，“液体活检”这一新的非侵入性的诊断概念受到了越来越多的关注，其针对循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、游离微小RNAs(microRNAs, miRs)和细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)等进行检测，以实现肿瘤的早期诊断。例如可通过循环肿瘤DNA来检测癌细胞的单核苷酸多态性、染色体拷贝数变异及甲基化变化等[2]。而包括外泌体在内的EVs因富含大量的miRs、DNA碎片和蛋白质等信息，具有作为生物标志物的巨大潜力。

一、EVs的形成机制、纯化及检测

EVs是活细胞分泌的、由脂质双层膜包裹的囊泡，根据其生物学方式分为三类：外泌体、微泡和凋亡小体。外泌体由多囊泡体与质膜融合，将管腔内囊泡释放至细胞外而形成，直径30～150 nm之间，富含CD81、CD63和CD9等标记物；微泡由质膜出芽直接形成，直径在50～1 000 nm 之间；凋亡小体由细胞凋亡过程中等离子体膜起泡或细胞破碎形成，直径一般超过500 nm[3]。不同种类的囊泡在大小上有一定的重叠，所以需要依靠其生物发生以及释放到细胞外环境的方式进行区分。

目前EV纯化方式有很多种，如根据要获得的囊泡的大小和密度，利用转速分离的差速离心法；基于一定的离心力下将EVs分配到密度梯度中某些特定位置上，形成不同区带进行分离的密度梯度离心法；基于EV大小不同进行分离的大小排阻色谱法以及根据不同EV表面标志物的差异进行分离的磁珠免疫亲和法等。不同技术在灵敏性、特异度和操作复杂度上各有优缺点。对于EV颗粒大小的检测，常用的技术有透射电子显微镜、动态光散射分析、纳米粒子跟踪分析(NTA)和流式细胞术(FC)，其中NTA和FC不仅可以检测EV颗粒的大小，还可以计算EV颗粒的浓度。在对囊泡内容物的检测方面，EV内蛋白质和RNA的种类及含量常用于疾病的监测，可以通过ELISA、Western-blot、质谱等方法检测蛋白，利用RT-qPCR、mRNA-seq和miRNA-seq测量RNA[4]。

二、EVs在HCC诊断及预后判断中的应用

EVs在细胞间通讯中发挥着重要作用，参与了很多生理及病理进程，包括肿瘤的发生、发展。一方面，抗原呈递细胞可通过摄取肿瘤细胞衍生的EVs所携带的抗原，激活CD8阳性T细胞，发挥抗肿瘤活性；另一方面，肿瘤细胞分泌的EVs中含有多种免疫调节因子，可以诱导局部微环境的免疫抑制，甚至影响循环免疫细胞的功能。此外，EVs中还含有大量促增殖和血管生成的细胞因子，极大地增强了肿瘤的增殖、转移及侵袭能力。许多研究表明，EVs的内容物在不同人群中存在差异，可通过测定其中的RNA、蛋白质及DNA水平等来对正常人群、原发性及复发性HCC患者进行鉴别[3]。不仅如此，EVs的内容物有外层脂质膜的保护，能够稳定地存在于循环血及体液中，其分离方式对患者的创伤小，可作为HCC诊断及预后判断的潜在标志物。

(一)RNAs 外泌体中有丰富的miRNAs，且与HCC及其复发密切相关。Sugimachi等[5]对HCC患者血清外泌体中miRs的表达谱进行分析发现，复发患者术前血清外泌体miR-718水平显著低于无复发患者，进一步实验证实，miR-718下调可导致HOXB8水平上升，促进HCC的发生和转移。分析患者血清外泌体功能性miRs的水平，不仅可以对HCC患者进行诊断，还可预测其复发风险，有利于治疗方案的选取。

长链非编码RNAs(lncRNAs)也参与了肿瘤的发生、发展，可作为HCC诊断的生物标志物。研究表明，HCC患者血清外泌体中的ENSG00000258332.1和LINC00635水平显著高于慢性乙型肝炎和肝硬化患者，且与门静脉肿瘤栓塞、淋巴结转移、TNM分期及总生存期相关。此外，将这两种lncRNAs与AFP联用可提高HCC诊断及预后判断的准确性[6]。

(二)蛋白质 外泌体携带的蛋白质同样在HCC发展中起到重要作用。实验表明，贴壁生长的HCC细胞衍生的外泌体中含有SMAD家族成员3(SMAD3)蛋白，有助于HCC细胞的黏附。外泌体中SMAD3蛋白的丰度与HCC的分期、病理分级和术后患者的无病生存率都有很高的相关性[7]。除可促进癌细胞迁移的SMAD3蛋白外，HCC细胞衍生外泌体中的多种钙结合蛋白、糖代谢调节蛋白等表达水平都与正常组织有显著差异，这使得外泌体中的蛋白质有着辅助诊断HCC及复发风险预测的潜力[8]。

(三)DNA 目前多数研究都集中在外泌体中的RNAs和蛋白质在HCC诊断方面的应用，关于HCC细胞释放的外泌体中DNA的功能及诊断价值尚缺乏详细报道。最新的研究表明，HCC患者血清中游离HBV DNA整合片段可用于肿瘤检测及术后复发风险预测。研究者检测了50例HBV相关HCC患者术前及术后两个月的血清样本中的病毒-宿主嵌合DNA片段，结果显示，88%的HBV相关HCC患者血清中能检测到病毒整合片段，且绝大部分患者血清中的病毒-宿主嵌合DNA拷贝数与肿瘤大小存在相关性[9]。值得注意的是，对比术前及术后整合片段的序列，26.2%的患者术后血清样本中的病毒-宿主嵌合DNA特征与基线时一致，而这些患者中有81.8%在1年之内就出现了HCC复发，这些结果提示，病毒-宿主嵌合DNA可用于HBV相关HCC的检测及预后判断，同时它还可与AFP联用以获得更好的诊断和预测价值。此前我们的研究也显示，绝大部分复发性HCC的DNA甲基化模式与其原发灶极为相似；而在HBV相关HCC的原发-复发癌配对样本中，可以检测到几乎完全相同的病毒-宿主嵌合DNA片段[10]。由于病毒整合片段可被释放到外周血中，因此也存在被包裹进EVs中的可能。虽然目前尚无文献报道，但EVs中的DNA比游离DNA更稳定，且纯化后容易进行定量检测，具备用于HCC检测及判断其复发风险的潜能。

三、EVs在HCC治疗中的应用探索

除了上述在实验室诊断方面的应用之外，EVs免疫原性低，生物相容性好，被认为是良好的递送载体，因此也有很多研究在关注其在HCC治疗方面的应用。miR-335已被报道具有肿瘤抑制作用，HCC细胞中miR-335表达水平普遍下调。有研究者利用肝星状细胞衍生的EVs将治疗性miR-335运输到HCC细胞内，抑制肿瘤增殖和转移，达到了良好的治疗效果[11]。而我们近期的研究发现，将CRISPR系统导入细胞内进行基因编辑时，Cas9蛋白和gRNA均可进入外泌体中，从而被其他细胞摄取并发挥基因编辑作用[12]。提示在体内应用CRISPR/Cas9技术对肿瘤进行治疗时，需要考虑到外泌体中有基因编辑活性的gRNA和Cas9蛋白可能带来的影响。

近年来越来越多的证据表明，EVs在HCC细胞的增殖、侵袭和转移中都有着重要作用，其携带的miRs、lncRNAs、蛋白质及DNA片段等均可作为HCC诊断和预后判断的标志物。但要将EVs实际应用于临床诊断还存在很多困难，如何快速且特异性地分离EVs的各种组分并对其进行检测还有待进一步探究。目前关于EVs诊断效能评价的研究较少，研究队列规模普遍偏小，还需要更大的样本量和多中心研究进一步验证。