肺动脉高压动物模型研究进展

陈豫钦 邝美丹 廖静 卢文菊 王健

呼吸疾病国家重点实验室 国家呼吸系统疾病临床医学研究中心 广东省血管疾病重点实验室 广州呼吸健康研究院 广州医科大学附属第一医院呼吸科

肺动脉高压 (pulmonary hypertension，PH)是一种进行性的致死性疾病，可导致肺血管阻力和肺动脉压力的进行性升高，从而发展为右心室肥厚、心力衰竭甚至死亡[1]。最新的流行病学数据估计，PH患病率约为全球人口的1%，65岁以上人群PH的患病率高达10%[2]。已经成为严重危害人民群众健康的一大类疾病。加强PH发病机制研究、推进新型药物研发是提高PH防治水平的必经之路。因此，建立稳定、可重复、与人类疾病发病机制及病理生理学特征相似且制作简单的动物模型是研究PH的基础。现将国内外制作PH模型的方法进行综述，以便研究者根据研究目的选择适合的动物模型。

1 PH动物模型的分类

按照造模方法分类可分为自发性PH模型和非自发性肺动脉模型。目前自发性PH模型主要是利用基因敲除(gene knock out)和基因嵌入 (gene knock in)技术获得相应的病理生理变化的转基因动物。而非自发PH模型则可利用外科手术、药物及各种环境因素制备。按照疾病产生的病理生理学始发因素，可以将PH模型分为动力性肺动脉高压 (hyperkinetic pulmonary hypertension)模型和肺血管阻力性肺动脉高压 (resistance pulmonary hypertension)模型。前者主要为高肺血流动物模型，以分流手术和肺叶切除手术构建的PH模型较为常见。后者包括低氧性PH动物模型、栓塞性PH模型、药物所致PH动物模型等。

2 实验动物的选择

目前用于制作PH的动物包括猪[3]、犬[4]、羊[5-6]等大型动物，以及兔[7-8]、大鼠、小鼠等小型动物。大型动物多应用于高肺血流动物模型以及栓塞性PH模型的制备。在高肺血流动物模型中，选用大型动物便于手术操作，且大动物对手术伤害有较好的耐受性、愈合能力强，与人类疾病的相似程度较高。但大型动物实验费用昂贵，动物饲养要求高，手术需要多人协助，其中最主要的缺点是无法进行大规模重复实验。因此，也有研究者采用大鼠制作高肺血流动物模型[9]，此模型对操作者手术技术要求高，但大鼠具有抗感染力强、易恢复的优点，适合手术造模。而栓塞性PH模型的稳定性差，制作复杂，一般使用大型动物的成功率较高。

小型动物中以大小鼠应用最为广泛，优点为遗传背景明确、性状稳定，且实验成本低，饲养方便，适合大规模研究。例如野百合碱 (monocrotaline，MCT)致PH模型和低氧性PH模型多采用大小鼠进行制备。而转基因动物研究的模型多以小鼠为主，这与小鼠繁殖力强、转基因成功率高有关。因此，在制备PH模型时应综合考虑研究成本、可操作性及动物的耐受程度，选择合适的动物种类。出于动物福利及研究的重复性，建议尽可能选用小型动物。另外，目前研究者多选用雄性动物制备PH模型，特别是低氧性PH模型，这与雌性动物对低氧具有较好耐受性有关。

3 常用的PH动物模型的制备

3.1 自发性PH模型 主要是利用基因敲除和基因嵌入，使模型动物中某种或多种基因不表达、低表达或过表达，从而自发PH，用于研究与干预基因相关的PH的发病机制。基因敲除可分为系统性基因敲除和条件性基因敲除。系统性基因即对动物体内所有的器官组织细胞中靶基因进行敲除，如小窝蛋白 (caveolin-1，cav-1)[10]、内皮一氧化氮合酶 (endothelial Nitric oxide synthase，eNOS)[11]及线粒体解偶联蛋白 (uncoupling protein 2，UCP-2)[12]基因敲除小鼠可自发轻到中度PH。条件性基因敲除是使特定组织器官或细胞中靶基因灭活，如肺内皮细胞BMPR2基因敲除小鼠[13]及内皮细胞的GATA-6基因敲除小鼠[14]可自发PH。有研究者利用Cre/LoxP技术得到PHD2在内皮细胞及造血细胞联合敲除的小鼠模型，该模型小鼠可自发严重的PH，在3.5个月时，右心室收缩压为60～90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 k Pa)，并出现新生内膜及丛样病变，病变呈进行性加重，80%的模型小鼠在6个月时死亡[15]。另外，基因嵌入是根据实验要求，在目的基因位置引进特定的突变或外源基因。如Chu等[16]通过给大鼠血液注射腺相关病毒携带血管生成素1的过表达载体 (adeno-associated virus-angiopoietin-1，AAV-Ang-1)使血管生成素1过表达，60 d后造成PH。5-羟色胺转运体 (5-Hydroxytryptamine Transporter，5HTT)[17]及IL-6[18]的过表达模型小鼠也可自发PH。

3.2 MCT致PH动物模型 是目前应用最为广泛的PH动物模型，该方法的优点为造模简单，成功率高，重复性好。缺点为动物死亡率高，与人类疾病发病机制差异较大。MCT致PH动物模型常出现ALI[19-21]、间质性肺纤维化[22-23]、坏死性肺动脉炎[24-25]、心肌炎[26-28]、肝毒性[29-30]等严重并发症。造模时MCT剂量为45～60 mg/kg体质量[31-33]，皮下或腹腔注射1次，21～30 d后即可造模成功。该模型的病理改变为肺血管平滑肌层明显增生，并伴有血管内膜增厚，这与其他PH动物模型及临床上PH患者病理改变不符。MCT导致PH的具体分子机制尚不明确，其引起肺血管重塑是由MCT介导的内皮损伤刺激肺动脉平滑肌细胞增生还是间质细胞肌化造成的还没有定论[21]。Xiao等[34]发现MCT可以直接激活钙敏感受体 (calciumsensing receptor，CaSR)，造成肺动脉内皮损伤，进而导致PH。还有研究报道MCT可以造成骨形成蛋白受体Ⅱ(bone morphogenetic protein receptor，BMPRⅡ)功能障碍和BMP信号中断[35]、引起NO信号通路障碍[36]、以及明确的肺血管内皮细胞损害[24，37]，这些都可能是其造成PH的部分分子机制。

3.3 低氧性PH模型 慢性低氧是引起PH的重要因素之一[38]。低氧性PH模型是进行第3类PH相关研究的首选模型，其优点为制作方便，重复性好，模型成活率高，适合小型动物造模，与临床疾病发病机制相似程度高。高原病及睡眠呼吸相关的PH采用该模型也具有较好的相似性。但是制作该模型需要专业的仪器设备，制作成本高。低氧性PH模型可分为常压低氧模型和低压低氧模型。制作方法多为低氧动物饲养箱10%氧浓度饲养动物14～21 d[39]。研究者多采用自制的简易缺氧箱，在模型制备过程中应注意避免箱体内高CO2，保证动物饲养环境。目前已有全自动的缺氧动物模型饲养箱研制成功，应用方便灵活，性能稳定，造模成功率较高。造模2～3周后动物肺动脉可出现病理改变，即显著的血管重塑及右心肥厚，动物体质量增长迟缓，并伴有肺部炎症细胞浸润[40]。低氧性PH模型可以模拟第3类PH患者低氧性血管收缩、炎症等改变，但无法模拟充气过度的机械刺激、毛细血管缺失、吸烟的毒性损伤等病理改变。

3.4 肺高血流模型 本模型是通过外科手术方法引起肺血流量的相对或绝对增加，从而造成肺动脉压力增高，与临床上部分先天性心脏病引起的PH以及部分栓塞性PH具有相似性。但是该类动物模型肺动脉压升高都不是很明显，且模型不稳定，动物死亡率高，只适用于大型动物。该模型制作方法多种多样，但都涉及复杂的外科手术，动物损伤大，并需要使用呼吸机，可以制作可逆性的PH模型。手术方法包括单侧肺动脉结扎[9]、颈动脉-肺动脉分流[7]、主动脉-肺动脉分流[41]、锁骨下动脉-主肺动脉吻合术[42]、胸主动脉-左肺动脉吻合术[43]等。该类模型的制作，动物的麻醉是手术成功的关键因素，目前常用的麻醉方法为氯胺酮与一种肌松药联用，术中根据动物体征变化给予维持剂量。先天性室间隔缺损的Yucatan小型猪继发PH模型也属于高肺血流模型的一种[44]。

3.5 严重PH模型 PH患者在临床上呈现难治性、进行性恶化的特征。大部分患者初诊时已经到达了严重阶段，很难用药物控制病情。因此，建立严重PH模型，对严重PH的发病机制及靶向药物的研究具有重要意义。严重PH模型应满足以下三个条件：一是肺动脉收缩压或右心室收缩压≥60 mm Hg；二是肺血管出现新生内膜或丛样病变；三是脱离刺激 (如低氧)后，病理改变不发生逆转。严重PH模型通常是采用 “双重打击”的方法建立，如低氧联合内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)抑制剂Sugen(SU5416)诱导的PH模型[45-47]、MCT联合内皮素受体B(endothelin Breceptor，ETBR)敲除模型[48]、低氧联合ETBR敲除模型[49]、低压低氧 (或低氧)联合MCT模型[50-51]、MCT联合左肺切除术模型[52]及Sugen联合左肺切除术模型[53]等。目前最常用的严重PH模型是Sugen联合缺氧诱导的PH(sugen hypoxia induced-pulmonary hypertension，Su Hx-PH)，该模型由于其病程与病理改变与严重PH患者具有较高相似性，主要用于第1类严重PH的相关研究。其制作方法为一次性皮下注射Sugen后，在10%氧浓度的环境下饲养3周，再置于常氧下数周 (1～11周)。模型鼠随着造模时间的延长，病变愈加严重，其肺血管内膜逐渐增厚，13～14周后，可出现丛样病变，肺循环阻力逐渐增加，心指数持续下降[45-47]。但是不同品系的大鼠，甚至是不同亚系的大鼠对sugen的反应有差异，通常采用SD(Sprague-Dawley)大鼠进行该模型的制备[54]。严重PH的小鼠模型目前尚存争议。

3.6 栓塞性PH模型 该模型与临床上第4型PH相似度高。根据栓子来源又可分为自体栓子栓塞法和异体栓子栓塞法，自体栓子多为动物自身血栓[55]，异体栓子包括乳胶微粒栓[56]、异体血栓、瓷栓[4]、气栓[5]、葡聚糖凝胶栓子[6]、气囊栓塞[57]等。该模型制作缺点为模型稳定性差，评价困难，制作复杂，需使用大型动物进行制作，且无法模拟临床上该类患者整体的血流动力学改变及血栓处理后的病理生理改变 (其中包括影响患者术后生存的肺组织缺血再灌注损伤)，大大限制了该类模型的应用。应用介入技术进行定位栓塞将成为该类模型未来制作的方向。

3.7 急性PH模型 多使用药物或者改变环境因素使模型动物在短时间内出现PH，一般停用药物或者脱离环境因素后便可恢复正常。此类模型能即时、直观的反应药物或者环境因素对肺动脉压力的影响，多应用于评价药物急性的舒血管作用及血流动力学急性改变的机制研究。最初主要选用大型动物如羊、猪用于模型制作，近年来越来越多的研究者用大鼠制备稳定的PH急性模型。目前急性PH模型主要是通过持续静脉注射前列腺素H2/血栓素A2受体激动剂U46619，动态监测肺动脉压力，使平均肺动脉压力稳定维持在一定高压范围内[58]。由于药物反应性不同，维持用药量在不同种属以及同一种属的不同个体的之间存在差异，因此实验前需要摸索给药浓度及剂量，使平均肺动脉压力能维持在一个稳定的范围至少30 min。一般1.0～2.0μg·kg-1·min-1[59]的给药速率可使羊的平均肺动脉压维持在25～30 mm Hg，另外有研究者用 (1.1±0.1)μg·kg-1·min-1的给药速率能使羊的平均肺动脉压达到35 mm Hg[60]。应用猪制备模型时可使用0.6～0.8μg·kg-1·min-1较小给药速率静脉注射U46619，其平均肺动脉压则可稳定在40 mm Hg左右达3 h[61]。而小型动物如大鼠给药速率维持在830～1 125 ng·kg-1·min-1[58]也可使平均肺动脉压维持在25～30 mm Hg。

PH因其发病机制复杂，因此造成PH动物模型制作方法众多，方法差异大，选用造模动物种类较多，但针对不同类型的PH已建立了与人类疾病具有较高相似度且比较稳定的动物模型。但各种造模方法都有其自身的优势和局限，已在上文中做了具体的论述。现在最成熟、最常用的PH动物模型为MCT致PH模型、低氧性PH动物模型和Su Hx-PH模型，但MCT致PH动物模型和低氧性PH动物模型无法完全模拟人类疾病的病理生理学改变，应该在研究中引起注意。肺高血流模型及栓塞性PH动物模型目前缺乏成熟的造模方法，无论外科手术或介入方法都存在动物损伤大、死亡率高、模型评价困难等问题。随着小动物影像评价技术的进步，通过介入技术进行微创定位栓塞或手术，将成为该类模型制作的趋势。基因编辑制备的自发性PH模型是研究PH发病机制的有效研究工具。除急性PH模型之外，PH动物模型的制作一般造模时间较长，涉及复杂外科手术及大型动物，并且存在模型制作及模型评价对动物造成重复伤害。因此在模型制作过程中应充分考虑动物福利，严格遵循实验动物福利Reduction(减少)、Replacement(替代)、Refinement(优化) “3R”原则，在此提出动物模型制作三点倡议：(1)尽可能选用小型动物，减少动物实验数量；(2)在满足实验要求的前提下减少造模时间，减轻造模过程中动物的痛苦；(3)充分参考其他研究者的造模经验。综上所述，PH动物模型的制备应当在具体的研究工作中根据研究目的、研究条件选用适当的动物模型。利用新技术、新仪器建立更符合人类疾病发生发展的模型是未来动物模型制作的发展趋势。