上皮-间充质转化在胃癌中的研究进展

刘骏强，徐岷

江苏大学附属医院消化内科，江苏镇江212000

胃癌是世界范围内第五大常见恶性肿瘤，其病死率居全球恶性肿瘤第3位，而东亚地区是全球胃癌发病率最高的地区[1]。目前，外科切除是胃癌唯一有效的治疗方式，但胃癌的早期诊断及治疗仍面临挑战，多数患者确诊时往往已经失去了手术根治的机会。因此，针对胃癌发生、发展的研究显得十分重要。近年来研究发现，上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与多种肿瘤的发生及肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭密切相关[2]。因此，本文针对EMT在胃癌中的研究进展作一综述。

1 EMT特征

细胞间各种连接及细胞极性维持了上皮细胞的完整性。在脊椎动物细胞中，上皮细胞连接包括紧密连接、黏附连接、缝隙连接和桥粒。另外，不同极性蛋白复合物分别定位于细胞顶端、细胞基底外侧区域，共同奠定细胞顶端-基底端极性基础。通常情况下，EMT是指上皮细胞逐渐失去细胞间连接及顶端-基底端极性，进而重组肌动蛋白构建新的细胞骨架，诱导板状伪足、丝状伪足及侵袭性伪足形成，同时促进基质金属蛋白酶的表达来降解细胞外基质，因此获得具有间质细胞的迁移及侵袭能力的可逆过程。EMT可分为3种类型，Ⅰ型EMT与胚胎发育有关，Ⅱ型EMT与组织再生与伤口愈合有关，Ⅲ型EMT与肿瘤发生、发展及肿瘤干细胞功能有关[3]。EMT应激启动后，上皮细胞的细胞连接解构，相关连接蛋白重新定位或降解[4]。同时，极性蛋白复合物的表达也受到抑制，上皮细胞失去典型的鹅卵石形态，变成纺锤样间质细胞形态，从而失去细胞完整性，细胞黏附能力降低，迁移能力提高，进而诱导肿瘤细胞从原发灶脱离，甚至浸润游走至远端部位[5]。

目前，已有研究发现，EMT相关蛋白标志物可以反映细胞的形态转变[6]。EMT过程中，上皮细胞黏附连接丢失，其关键蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin，CDH1）转化为间质细胞标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin，CDH2），从而导致CDH1表达下调和CDH2表达上调。此外，钙黏蛋白间的转化受到EMT相关转录因子的调控，细胞应激后EMT转录因子发生核易位，如SNAIL家族、E盒结合锌指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox，ZEB）可以直接或间接地抑制CDH1表达，促进CDH2、波形蛋白（vimentin）等表达，这些转录因子对EMT关键蛋白的调控机制进一步证明了EMT在肿瘤生物学运动中的重要作用[7]。

2 信号通路

胃癌细胞在肿瘤微环境中受到生长因子、缺氧、炎性因子、新陈代谢等不同信号分子刺激后，应激激活相关信号通路，刺激下游转录因子参与EMT过程，进而影响其增殖、迁移及侵袭等生物学运动。

2.1 WNT/ β-连环蛋白通路

经典WNT/β-连环蛋白（β-catenin）通路可以参与调控肿瘤细胞的EMT，β-catenin可以直接与细胞内的CDH1结合，而α-连环蛋白连接肌动蛋白，三者形成的复合物可以维持上皮细胞的稳定及黏附；同时，钙黏蛋白-连环蛋白复合物也可以抑制βcatenin的核转移。细胞中WNT配体和受体结合应激后，可以抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/轴蛋白（axin）/大肠腺瘤样息肉（adenomatous polyosis coli，APC）蛋白复合物磷酸化降解细胞内游离的β-catenin；而细胞内βcatenin逐渐积聚后，可以转入细胞核内进一步与T淋巴细胞趋化因子（T lymphocyte chemotactic factor，TCF）/淋巴样增强因子（lymphoid enhancer factor，LEF）结合，促进EMT转录因子SNAIL、TWIST的表达，抑制CDH1的表达，进而促进胃癌细胞的迁移、侵袭[8]。另一方面，CDH1负性调控WNT通路，伴随细胞间连接分解，CDH1和β-catenin结合分解，释放的β-catenin积聚在细胞质中，β-catenin在WNT信号启动时发生核易位。

此外，非经典WNT通路也参与了EMT过程，比如过表达WNT5A可以增强胃癌细胞中SNAIL、vimentin、CD133蛋白及信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表达水平，反之低表达WNT5A则可以抑制EMT及肿瘤干细胞的活性[9]。

2.2 TGF-β/SMAD信号通路

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/SMAD信号通路可以参与调节多种肿瘤细胞的EMT过程。TGF-β与转化生长因子-β受体（transforming growth factor-β receptor，TGF-βR）（TGF-βR1、TGF-βR2）相结合，可以磷酸化下游信号转导分子SMAD家族成员2（SMAD family member 2，SMAD2）、SMAD 家族成员 3（SMAD family member 3，SMAD3）；SMAD2、SMAD3、SMAD家族成员4（SMAD family member 4，SMAD4）结合后形成三聚体复合物并进入细胞核，激活EMT诸多转录因子，进而促进CDH1降解，增高CDH2表达水平[10]。不仅如此，TGF-β/SMAD信号通路还可以协调其他信号通路[WNT/β-catenin通路、Notch通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等]维持肿瘤间质细胞表型[11]。比如抑癌基因RUNX3的缺失可以诱导TGF-β、WNT通路异常调节，进而促进胃EMT过程并增强干细胞活性蛋白——富含亮氨酸重复单位的G蛋白偶联受体5（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5）的表达[12]。

2.3 MAPK信号通路

MAPK是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，参与肿瘤细胞基本生物学运动。MAPK通常有细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）-MAPK、p38-MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和BMK（ERK5）4个级联信号通路，且各个级联信号通路均可以通过EMT促进胃癌细胞的迁移和侵袭。凋亡因子FAS配体介导的胃癌细胞可以通过ERK1/2抑制GSK-3β的磷酸化，进而减弱GSK-3β对β-catenin降解作用，并促进β-catenin、SNAIL蛋白在细胞核内积聚，诱导胃癌细胞EMT，而且β-catenin、SNAIL蛋白表达可以被ERK抑制剂U0126所阻断[13-14]。另外，抑癌基因RASSF6可以抑制p38的磷酸化，减弱胃癌细胞上皮向间质表型的转变，同时p38-MAPK抑制剂SB203580可以逆转Ras关联结构域家族成员6（（Ras association domain family member，RASSF6）对p38磷酸化的调控，减弱EMT进程[15]。此外，活化JNK通路可以促进胃癌细胞EMT，反之JNK抑制剂也可以逆转EMT进展，削弱胃癌细胞的迁移能力[16-17]。虽然关于BMK通路的研究较少，仍有文献报道烟草烟雾可刺激小鼠胃组织ERK5的磷酸化，进而诱导EMT发生，提示吸烟是胃癌发生的风险因素[17]。

2.4 Notch信号通路

Notch信号通路：哺乳动物通常具有Notch受体（NOTCH1～4）和配有DSL（DELTA/serrate/LAG2）结构域的典型配体（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2）。经典Notch途径下，配体与受体结合后，可以激活Notch胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD）转移至细胞核，与目的蛋白形成二聚体，进而促进下游基因转录；而活化Notch信号能够调控胃癌EMT相关蛋白的表达。如NOTCH1与其配体结合后，可以刺激NICD和β-catenin转入细胞核形成复合物，从而促进上皮形态标志物CDH1的表达，抑制间质形态标志物CDH2和vimentin的表达，促进胃癌细胞增殖，抑制胃癌细胞凋亡[18]。另外，NOTCH1受体与Jagged1配体结合后，NICD1应激诱导信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化，增强EMT启动子TWIST的活性，进而促进胃癌细胞生长[19]。近年来研究发现，Notch信号通路可以协同其他信号通路影响胃癌细胞EMT，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号通路激活可以巩固NICD/β-catenin复合物的稳定性[18]。NOTCH4也可以通过促进WNT1的表达，促进βcatenin进入细胞核，进一步上调下游c-myc和细胞周期蛋白（cyclin）D1的表达，通过WNT1/β-catenin通路促进胃癌细胞生长[20]。更值得关注的是，Notch受体可以根据不同的肿瘤类型表现为癌基因或抑癌基因，其受体表达水平和信号级联的多样性可能是原因之一。有文献报道，NOTCH2可以通过PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞的侵袭能力，从而证实了NOTCH2的抑癌作用[21]。上述研究表明，Notch信号通路在胃癌发生、发展机制的研究中仍需进一步完善。

2.5 PI3K/AKT信号通路

PI3K/AKT信号通路在胃癌细胞EMT中发挥着重要作用。当胃癌细胞受到外界刺激后，AKT的丝氨酸第473位点或苏氨酸第308位点磷酸化，下游信号雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）及核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）磷酸化增强，负性调节分子第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（ph osphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN）表达下调，进而促进EMT发生[3]。GSK-3β为AKT的主要靶标，激活AKT可以促进GSK-3β的磷酸化降解，进而抑制GSK-3β对β-catenin的降解，因此PI3K/AKT信号通路可以协同WNT信号通路参与调控胃癌细胞EMT。与多柔比星敏感胃癌细胞株相比，质子泵抑制剂泮托拉唑可以减少多柔比星耐药SGC7901/ADR细胞株中 AKT、GSK-3β的磷酸化，通过 AKT/GSK-3β/βcatenin信号通路逆转耐药细胞株EMT进展，从而抑制多柔比星耐药胃癌细胞株的迁移及侵袭[22]。

3 miRNA和胃癌EMT

微小RNA（micro RNA，miRNA）是真核生物中一类具有调控功能的非编码RNA，由20～25个核苷酸组成，miRNA可以通过对自身表达水平的改变调控相关目的基因的表达，从而发挥癌基因或抑癌基因的作用。miRNA参与调控多个肿瘤的发生发展，包括对胃癌细胞EMT的影响[23]。

miRNA-506通过与SNAIL2miRNA的3'-UTR结合，抑制SNAIL2的表达，进而上调CDH1表达[24]。高表达的miRNA-204通过直接靶向Ⅱ型转化生子因子-β受体（transforming growth factor-β receptor typeⅡ，TGF-βR2），抑制SMAD2、SMAD3磷酸化，从而抑制胃癌细胞上皮形态向间质形态的转变，提高胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[25]。而上调miRNA-544a表达可以抑制WNT信号通路GSK-3β/axin/APC复合物中轴抑制蛋白（axis inhibition protein 2，AXIN2）的表达，促进β-catenin核易位，上调vimentin、SNAIL1、ZEB1的表达及促进CDH1的降解[26]。另外，部分miRNA还具有促进EMT的作用。miRNA-592可以通过协同PI3K/AKT信号通路和MAPK/ERK信号通路诱导EMT，并促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭[27]。miRNA-181a-5p参与了RASSF6介导的胃癌细胞EMT，为晚期胃癌的治疗提供了一个潜在靶点[15]。

4 幽门螺杆菌和胃癌EMT

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是一种革兰阴性杆菌，通过利用自身螺旋的特性及鞭毛的蠕动穿过黏液层，定植在黏液下层和胃黏膜上皮表面。HP可以诱导胃黏膜发生慢性炎性反应、消化道溃疡，甚至逐步进展到胃癌。早在1994年，世界卫生组织（WHO）将HP感染定义为人类Ⅰ类（即肯定的）致癌原。HP可以诱导胃黏膜相关淋巴组织（mucosa-associated lymphoid tissue，MALT）淋巴瘤的发生、发展[28]，经抗HP治疗后，部分胃MALT淋巴瘤患者的症状改善，淋巴瘤消失。2005年，Marshall和Warren因为证实了HP的存在获得了诺贝尔奖。

HP通过诱导宿主上皮细胞EMT参与早期胃癌的发生、发展过程。Choi等[29]对根除HP与EMT进行相关性研究，结果发现阴性对照组、异型增生组和胃癌组受试者的活检组织中EMT相关基因（TWIST、SNAIL、SLUG、vimentin）的mRNA 表达水平依次递进升高，而CDH1mRNA的表达水平逐渐降低；该研究还发现，根除HP感染1年后，阴性对照组受试者的活检组织中TWIST、SNAIL、SLUG、vimentin的mRNA表达水平均较HP感染阳性时明显下降，而CDH1mRNA表达水平较HP感染阳性时增高，且该种差异在胃癌组中更加明显。

在HP影响EMT机制研究中发现，细胞毒素相关基因 A（cytotoxin associated gene A，CAGA）是HP分泌的主要毒素因子。CAGA进入宿主细胞内后，自身羧基端磷酸化形成一个信号中枢，可以招募多种蛋白质与其结合。HP可以直接粘附在胃上皮细胞，尤其是上皮细胞间连接处。CAGA既可以重新定位紧密连接相关蛋白闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、连接黏附分子（junctional adhesion molecule，JAM）以及黏附连接蛋白CDH1至菌株带，也可以抑制极性蛋白酶活化受体1（protease-activated receptor 1，PAR1）和非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，aPKC）的活性，使细胞失去顶端-基底端极性。同时，伴随钙黏蛋白-连环蛋白复合物中CDH1蛋白的降解，β-catenin核转位增强，共同诱导EMT的发生、发展[30]。另外，体外实验发现，CAGA可以通过直接抑制GSK-3β的活性，减弱β-catenin降解，同时促进SNAIL转录因子表达，激活WNT/β-catenin通路，进而促进EMT进展[31]。已有研究发现，CAGA可以诱导癌基因Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）的表达并促进其进入细胞核，通过YAP通路促进EMT进程[32]。

5 小结

综上所述，EMT在胃癌发生和胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭中扮演重要角色，不同信号因子刺激肿瘤细胞可以通过诸多机制通路影响EMT，调控胃癌生物学运动。由于EMT进程是可逆的，因此有希望通过干预相关有效靶点逆转胃癌EMT，从而为今后胃癌的治疗提供可靠的理论依据。