同/异质型乳酸菌添加对苏丹草青贮酵母菌群落结构及发酵品质的影响

万江春，谢开云，王玉祥，赵 云，刘 莉，玉 柱

（1. 新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆草地资源与生态重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 中国牧工商集团有限公司，北京 100070；3. 中国农业大学动物科技学院，北京 100093）

苏丹草(Sorghum sudanense)原产于非洲，是禾本科高粱属一年生优良牧草。苏丹草性喜温，耐贫瘠，抗旱，营养价值高，再生力强，可多次刈割[1-3]，目前已在新疆地区广泛种植。新疆地域广阔，在雨热同期地区，青贮是重要的饲草加工方式。青贮主要是利用乳酸菌发酵产生乳酸来降低青贮饲料的pH，进而抑制其他有害微生物的生长和繁殖，从而达到长期保存的目的[4]。乳酸菌可分为两类，一类为同质型乳酸菌，另一类为异质型乳酸菌。同质型乳酸菌主要包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(L. plantarum)、乳酸片球菌(Pedicoccus acidilactici)、戊糖片球菌(P. pentosaceus)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)和屎链球菌(S. faceium)等，这类乳酸菌的共同特点是同型发酵，他们可有效利用植株中的可溶性碳水化合物，增加乳酸产量并迅速降低pH。布氏乳杆菌(L. buchneri)是常见的异质型乳酸菌[5-6]，特点是在青贮发酵过程中除产生乳酸外，还产生乙酸，但他将水溶性碳水化合物转化为乳酸的效率远远低于同质型乳酸菌。布氏乳杆菌发酵终产物中所产乳酸含量与同质型乳酸菌发酵终产物中所产乳酸含量相比，仅有其17%～50%。过去认为酵母菌在青贮饲料中的数量很少，但近年来的许多研究表明酵母菌在青贮饲料中的数量并不少[7-9]。多数研究认为，青贮饲料中酵母菌的活动不利于青贮饲料的发酵及有氧稳定，这主要是因为酵母菌会与乳酸菌争夺糖分并发酵，除产生乙醇外，酵母菌还会进一步发酵醇类物质，进而产生正丙醇、异戊醇、异丁酸以及少量的乳酸等[10-11]，这些物质并不能提高青贮饲料的发酵品质及有氧稳定性。酵母菌在青贮过程中是不可避免的存在，而且数量也不少，但是目前缺乏同/异质型乳酸菌添加剂对酵母菌在青贮过程中的酵母菌种群动态变化关系方面的研究。

苏丹草作为一种优质牧草，目前新疆已开始大面积种植，但如何提高青贮后的饲料品质却成了亟待解决的问题。本研究以植物乳杆菌作为同质型乳酸菌添加剂，以布氏乳杆菌作为异质型乳酸菌添加剂，探讨其作为添加剂对苏丹草青贮饲料发酵过程中酵母菌群落及发酵品质的影响，以期提高苏丹草青贮饲料的品质，为开发乳酸菌与酵母菌共生性产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

苏丹草种植于新疆乌鲁木齐市三坪农场新疆农业大学校内实习基地 (43°54′ N，87°19′ E)。该区域属于典型的中温带大陆性半干旱气候，7月平均气温 24.5 ℃，年降水量 180 mm，年均蒸发量1 780 mm，＞10 ℃ 年积温 3 500 ℃·d，光照时间长，年均日照时数 2 900 h，无霜期 170～180 d。

1.2 原料与加工调制

苏丹草原料：以新苏3号苏丹草(新疆草地资源与生态重点实验室提供)为种植品种；苏丹草种植小区面积为 100 m2(10 m × 10 m)，重复 3 次；小区内播种行距 15 cm，播种量为 105 kg·hm-2。2017 年4月28-30日进行苗床的准备，包括犁地、耙地和施基肥 (磷酸一铵，90 kg·hm-2)；5 月 2 日完成小区播种；抽穗期进行刈割(2017年7月20日)；将原料凋萎12 h后切短至1～2 cm待贮。

原料青贮特性：凋萎12 h后的苏丹草，其干物质含量为284 g·kg-1，附着的乳酸菌数量为3.51 lg cfu·g-1。基于干物质测定的粗蛋白含量为98.6 g·kg-1，可溶性碳水化合物含量为52.4 g·kg-1，酸性洗涤纤维含量为 613 g·kg-1，中性洗涤纤维含量为 324 g·kg-1，粗脂肪含量为 26.3 g·kg-1，粗灰分含量为 81.4 g·kg-1，缓冲能值为 169 mEq·kg-1，pH 为 4.85。

添加剂：植物乳杆菌 CGMCC 10474 (LP)和布氏乳杆菌 CGMCC 14268 (L. buchneri，LB)均由中国农业大学草地研究所提供。

1.3 青贮试验方法

以收获凋萎12 h后的苏丹草为原料，利用真空包装袋为青贮容器制作青贮。乳酸菌处理为3种：同质型乳酸菌处理(LP)-植物乳杆菌，添加量为1 × 105cfu·g-1；异质型乳酸菌处理 (LB)-布氏乳杆菌，添加量为 4 × 105cfu·g-1；同质型+异质型乳酸菌处理 (LP + LB)，添加量为植物乳杆菌 1 × 105cfu·g-1+布氏乳杆菌 4 × 105cfu·g-1；以不添加任何菌剂的空白为对照处理(CK)。各处理均将提前按比例配置好的菌液用喷壶均匀喷洒至样品表面，CK处理喷洒等量的蒸馏水。青贮调制48袋，每个处理12袋，每袋 1.0 kg，室温环境 (23～36 ℃)下发酵 60 d。在发酵1、7、15和60 d时分别取各处理样品(每个处理取3个重复)进行相关指标的测定。

1.4 各指标测定方法

原料的分析样品在65 ℃下干燥48 h，粉碎，过0.425 mm筛孔制成[12]。取原料风干样参考Zhang等[13]的方法测定以下指标：干物质含量(dry matter, DM)采用烘干法，粗蛋白质(crude protein, CP)采用凯氏定氮法，中性洗涤纤维 (neutral detergent fiber, NDF)和酸性洗涤纤维 (acid detergent fiber, ADF)采用 Van Soest洗涤纤维素分析法，粗脂肪 (ether extract, EE)采用索氏抽提法，粗灰分采用灰化法，可溶性碳水化合物 (water soluble carbohydrate, WSC)采用分光光度法，缓冲能值 (buffer energy, BC)采用滴定法。

参考王慧丽[11]的方法进行酵母菌的分离、纯化及保存等，参考Zhang等[14]的方法进行乳酸菌及酵母菌数量的测定。发酵品质的测定指标主要包括pH(雷磁酸度计，PHS-25)、乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸 (Acetic acid，AA)、丙酸 (propionic acid，PA)和丁酸 (butyric acids，BA)(高效液相色谱法)[11]；氨态氮(NH3-N)采用苯酚-次氯酸比色法测定[15]。

V-score评分方法参考日本粗饲料评定手册(2001)[16]，该方法是以NH3-N和AA、PA、BA等挥发性脂肪酸为评定指标进行青贮品质评价的方法。

1.5 数据分析

采用MEGA 7.0进行酵母菌种群系统进化树的构建，利用SigmaPlot 14.0进行相关图表的绘制，利用SPSS 21.0软件进行方差分析，用Duncan法对测定数据进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 苏丹草原料及青贮发酵过程中分离的酵母菌

从苏丹草原料及整个发酵过程青贮饲料中共分离得到132株酵母菌。分离和纯化酵母菌，使用单链构象多态性分析对其进行初步筛选，之后进行26S rDNA的D1/D2区序列测定，通过BLAST在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列及相关信息检索，将酵母菌鉴定到种水平，通过Mega 7.0构建系统发育树(图1、表1)。

从苏丹草原料及青贮苏丹草中共检出9种酵母菌(表1)，除了Y7与Kluyveromyces marxianus模式菌株相似度为98.7%之外，其余菌株与模式菌株的相似度均在99.0%以上。所有分离得到的酵母菌菌株与GenBank上检索得到的模式菌株均处于同一分支且重复抽样分析值都在98%以上 (图1)，因此分离得到9种酵母菌与对应的模式菌株均属于同一种。

2.2 苏丹草青贮发酵过程中检出的酵母菌种类

青贮前及青贮发酵的1、7、15和60 d，对苏丹草青贮饲料中的酵母菌种类和比例进行鉴定(图2)。结果显示，青贮发酵前，从4种处理中共检测出9种酵母菌，只有Z. bailii是在每个处理中均检出的酵母菌品种，且检出比例较高，超过了40%；随着青贮发酵时间的延长，酵母菌种类不断减少，至发酵 60 d 时，LB 和 LP + LB 处理中酵母菌含量已在检出限以下 (＜ 2.4 lg cfu·g-1)；与 0 d 时相比，CK和LP处理各减少了两种酵母菌，分别是C.glabrata、C. quercitrusa 和C. glabrata、P. kudriavzevii；Z. bailii在4个处理中的检出比例均出现一定程度下降，尤以LB和LP + LB处理明显，至青贮60 d时，LB和LP + LB处理中已检测不到Z. bailii。

2.3 同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵过程中酵母菌群落的影响

随着青贮发酵的进行，各处理青贮饲料的pH均逐渐降低。CK和LP处理均未能有效抑制酵母菌数量，与0 d相比，发酵1 d后，酵母菌数量开始增加；LB处理发酵1 d后，酵母菌数量和pH同步下降；LP + LB 处理从 0 至 60 d，酵母菌数量随着pH的下降而下降；随着发酵时间延长，各处理酵母菌种类均出现不同程度减少，至60 d时，LB和LP + LB 处理酵母菌数量均在检出限以下 (图 2)。

图1 苏丹草青贮饲料发酵过程中分离的酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列系统进化树Figure 1 Phylogenetic tree of 26S rDNA D1/D2 region sequence of yeast during silage process of Sudangrass

2.4 同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响

添加同/异质型乳酸菌显著提高了苏丹草青贮饲料发酵品质。与对照相比，同/异质型乳酸菌显著降低了苏丹草青贮饲料的pH、PA、BA、NH3-N以及酵母菌数量，同时显著增加了LA和乳酸菌数量 (P＜0.05)(表 2)；V-score 评分依次为 LP ＞ LP +LB ＞ LB ＞ CK，LP 处理达到了 91，LP + LB 处理评分也达到了86，均达到优质青贮饲料的评分标准。

3 讨论

从苏丹草原料及青贮饲料中共检出9种酵母菌，分别是Z. bailii、C. tropicalis、C. ethanolica、C.rugosa、C. glabrata、C. quercitrusa、K. marxianus、S. cerevisiae和P. kudriavzevii，这些酵母菌菌种已在相关研究报道中出现[17-19]。酵母菌具有很高的营养价值，特别是含有较多的蛋白质、B族维生素、核酸和矿物质等，同时也能产生一些保健功能的活性物质。然而在青贮饲料中，酵母菌的存在却是不利的，往往认为酵母菌是引起青贮饲料有氧变质的主要原因[9, 14]。过去认为酵母菌在青贮饲料中只是少量的，但是近年来大量的研究证明酵母菌在青贮饲料中的数量并不少[7-8, 10]，但鉴定到种水平的酵母菌研究则较少。王慧丽[11]对TMR原料有氧状态下的酵母菌群落进行了相关研究，推测C. tropicalis在TMR好氧变质过程中不起作用或起较小作用，而K. marxianus、C. glabrata和P. kudriavzevii则可能参与了好氧变质过程。本研究中，在CK和LP处理中，Z. bailii所占比例在相当长的时间内占据绝对优势，直至青贮发酵60 d时，Z. bailii所占比例仍旧超过30%，而LB和LP + LB处理组中的Z. bailii则最先受到抑制，但Z. bailii是否是苏丹草青贮饲料有氧变质过程中起主要作用的酵母菌仍需更进一步的研究。

图2 苏丹草在青贮发酵过程中pH、酵母菌数量及其组成的变化Figure 2 Changes in pH and yeasts and their composition during the silage process of Sudangrass

表2 同/异质型乳酸菌对苏丹草青贮发酵指标的影响Table 2 Effects of Sudangrass silage with homo-and hetero-fermentative lactic acid bacteria on fermentation

布氏乳杆菌属于异型发酵型乳酸菌，在青贮发酵过程中除产生乳酸外，还产生乙酸[5]，乙酸被认为是抑制酵母菌活动的主要限制因素[20-21]。除此之外，初始pH的高低也会影响到布氏乳杆菌抑制酵母菌群落的作用效果[22]，当初始pH低于5.0时，布氏乳杆菌的使用可有效增加青贮饲料中乙酸的含量，进而抑制酵母菌的活动[23-24]。本研究中，与对照相比，随着发酵过程中厌氧条件的逐渐形成及pH的迅速下降，含有布氏乳杆菌处理的青贮饲料的酵母菌逐渐受到抑制，具体表现在酵母菌的种类和数量都有所减少，至青贮60 d时，LB和LP + LB处理中酵母菌均已在检出限以下。本研究中，苏丹草原料的初始pH为4.85，在这一条件下布氏乳杆菌的添加能有效抑制酵母菌的生长和繁殖，这与上述研究结论相一致。

大量试验表明，饲料青贮过程中同质型/异质型乳酸菌都起作用，在青贮饲料中无论添加同质型乳酸菌还是异质型乳酸菌，都能够改善饲料的青贮品质[25-26]，不同的是，同型发酵乳酸菌作为添加剂使用后可迅速降低青贮饲料的pH，同时降低NH3-N和BA含量，但其发酵产生的挥发性脂肪酸含量较低，对于霉菌和酵母菌等的生长和繁殖抑制效果有限，在贮藏和取用过程中更容易发生腐败[27-29]，而异型乳酸菌的使用却能提高青贮饲料中的乙酸含量并提高其有氧稳定性[30-31]。Driehuis等[32]的研究表明，布氏乳杆菌可将1 mol乳酸降解为0.48 mol乙酸、0.48 mol 1,2-丙二醇、0.04 mol乙醇和 0.52 mol CO2。Holzer等[33]的研究则表明，布氏乳杆菌能有效抑制青贮过程中酵母菌等真菌的生长，改善青贮发酵有氧稳定性。本研究中，单独使用植物乳杆菌的LP处理组，在青贮发酵60 d时，虽然酵母菌的种类有所减少，但是相较于0 d时，酵母菌数量反而还有所增加，这和上述研究结果相似；使用布氏乳杆菌的处理，其乙酸含量显著(P＜0.05)高于未使用处理，但是否能有效增加苏丹草青贮饲料的有氧稳定性，仍需更进一步的研究。

以往 对 玉米 (Zea mays)[5, 34]、羊 草 (Leymus chine nsis)[13]及小麦(Triticum aestivum)[27]的青贮研究发现，植物乳杆菌和布氏乳杆菌进行联合接种时，对发酵底物产物和微生物的数量影响并不明显。本研究中，与对照组相比，LP + LB处理可显著(P＜0.05)降低苏丹草青贮饲料的 pH、PA、BA、LA/AA的比值、NH3-N以及酵母菌数量，同时显著(P＜0.05)增加LA含量和乳酸菌的数量，V-score评分也较高，达到了86。这与上述研究结果存在差异，这可能与原料的青贮特性以及青贮前的加工调制方法有关(本研究中的苏丹草原料新鲜刈割后进行了凋萎处理)。

4 结论

与对照相比，单独或混合添加植物乳杆菌和布氏乳杆菌均可显著提高苏丹草青贮饲料的发酵品质；单独添加植物乳杆菌可有效减少酵母菌的种类，但不能有效抑制酵母菌的数量，布氏乳杆菌和植物乳杆菌 + 布氏乳杆菌混合添加可有效抑制酵母菌的种类和数量。综合考虑发酵品质及提高苏丹草青贮饲料有氧稳定性等因素，以植物乳杆菌 + 布氏乳杆菌处理效果较好。