负压封闭引流干预创伤后应激代谢的实验研究

陈驾君，杨 帆，解 杰，王 翔，胡 耑，白祥军

挤压伤后缺血组织可发生再灌注损伤和代谢性酸中毒[1]。当恢复再灌注时，如果纠酸过快会导致酸碱(pondus hydrogenii，pH)反常[2]；过慢则会损伤线粒体，加重代谢障碍和酸中毒[3]，从而诱发“致死性三联征”[4]。因此，如何调控代谢平衡，成为缺血后预处理(ischemic postconditioning)研究的方向之一[5]。

负压封闭引流(vacuum sealing drainage，VSD)技术临床上可显著改善挤压伤预后[6]。实验证实，其可通过减轻炎症反应和调节活性氧含量，改善缺血再灌注损伤[7]，并与糖酵解酶密切相关[8]。因此，笔者拟通过动物实验观察VSD技术对再灌注后己糖激酶2(hexosekinase，HK2)、磷酸果糖激酶1(Phosphofructokinase1，PFK1)，丙酮酸激酶M1(pyruvate kinase M1，PKM1)、乳酸盐脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)、丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase4，PDK4)，丙酮酸(pyruvic acid，PA)和乳酸(lactic acid，LA)，以及pH值和阴离子间隙(anion gap，AG)值的影响，以探讨其保护作用的可能机制。

材料与方法

1实验动物建模和分组

雄性新西兰白兔30只，饲养和科学操作均符合《实验动物管理条例》。称重后按照150 mg/kg的剂量，耳缘静脉注射盐酸氯胺酮注射液麻醉，按文献报道[7]制备缺血再灌注损伤模型。将动物随机分为3组，即假手术组、缺血再灌注组(I/R组)和VSD干预的缺血再灌注组(I/R+VSD组)，每组10只。(1)假手术组动物仅完成左后肢股动静脉组织游离，为假手术对照；(2)I/R组动物完成组织游离后进行左后肢股动静脉的夹闭(6h)及开放(6h)，不进行VSD干预；(3)I/R+VSD组动物在进行再灌注的同时对损伤处予以VSD(-70kPa，6h)干预。

2主要仪器、材料和试剂

(1)仪器：Shimadzu LC-10AVP高效液相色谱检测仪(日本岛津株式会社)、GEM Premier 3000全自动血气分析仪(美国Instrumentation Laboratory公司)；(2)材料：VSD一次性使用负压引流护创材料(武汉维斯第公司)；(3)试剂：HK2检测试剂盒(美国Blue gene公司)、PFK1检测试剂盒(美国Aviva systems biology公司)和PKM1检测试剂盒(美国Elabscience 公司)；(4)免疫印迹法：LDHA抗体和PDK4抗体(美国Aviva systems biology公司)。

3样本取材和检测

(1)糖酵解限速酶：实验结束后将兔处死，使用冰去离子水对获取的骨骼肌组织进行冲洗匀浆，低温离心机以3 000r/min离心10min，取上清以酶联免疫吸附法进行检测。

(2)糖酵解相关酶：引入β-actin作为内参，采用免疫印迹法检测。分别于建模时(0)、再灌注前(4h)和实验结束后(10h)3个时间点在损伤肌肉同一区域取材，取漂洗干净的骨骼肌组织，提取总蛋白进行15% SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，封闭过夜后，依次加入抗体，使用化学发光法进行显色。

(3)糖酵解代谢产物：处死后使用冰去离子水对获取的组织进行冲洗，取100mg加入0.9%NaCl(含0.5mmol/L EDTA-2Na)和3%HClO4溶液制成10%匀浆液，依次沉淀蛋白、离心、取上清，应用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为：5μm，C18柱(3.9mm×150mm)，流动相为95%磷酸盐缓冲液(PBS)和5%甲醇(MeOH)，调pH至2.5，等比洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长220nm，柱温20℃，进样量10μL。

(4)血气：分别于建模时、再灌注前、处死前3个时间点，于兔左后肢股动脉处抽取动脉血3mL，应用全自动血气分析仪进行检测。

4统计学分析

结果

1骨骼肌组织中糖酵解限速酶的变化

与假手术组比较，I/R组和I/R+VSD组在实验结束后测的HK2、PKF1和PKM1均显著性升高(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+VSD组在实验结束后测的各值均显著性升高(t=2.609，P=0.030；t=2.258，P=0.040和t=1.850，P=0.047)。见表1。

与假手术组相比：*P<0.05，**P<0.01；与缺血再灌注组相比：ΔP<0.05

2骨骼肌组织中糖酵解相关酶表达的变化

与假手术组比较，I/R组和I/R+VSD组在建模时(0h)、再灌注前(4h)和实验结束后(10h)LDHA表达相对灰度比分别为1.011±0.007和0.985±0.016、25.492±4.441和24.388±4.663、20.613±4.753和28.177±5.283；而PDK4表达相对灰度比分别为0.997±0.004和1.013±0.009、17.440±3.263和16.998±3.528、15.438±4.125和22.492±6.552；其中，I/R组和I/R+VSD组在再灌注前和实验结束后LDHA和PDK4表达显著性升高(F=2.996，P=0.049和F=18.561，P<0.001，F=4.265，P=0.024和F=26.856，P<0.001)；与I/R组比较，I/R+VSD组实验结束后LDHA和PDK4表达显著性升高(t=2.768，P=0.031和t=3.005，P=0.025)。见图1。

3骨骼肌组织中糖酵解代谢产物和比值的变化

与假手术组的PA、LA和LA/PA比值[(0.259±0.044)mmol/L、(2.351±0.303) mmol/L和9.077±0.689]相比较，I/R组和I/R+VSD组在实验结束后分别为(0.382±0.033)mmol/L和(0.365±0.047) mmol/L、(5.688±1.153)mmol/L和(4.285±0.937)mmol/L、14.890±1.349和11.740±1.001，均显著性增高(F=4.221，P=0.025，F=16.482，P<0.001和F=20.480，P<0.001)；与I/R组比较，I/R+VSD组LA和LA/PA比值在实验结束后均显著性降低(t=3.960，P=0.023和t=4.258，P=0.018)。见图2。

与假手术组相比：*P<0.05，**P<0.01；与缺血再灌注组相比：ΔP<0.05

与假手术组相比：*P<0.05，**P<0.01；与缺血再灌注组相比：ΔP<0.05

4外周动脉血中血气值的变化

与假手术组比较，I/R组和I/R+VSD组pH值、AG值在处死前显著性变化(F=2.260，P=0.040和F=2.562，P=0.032)，但是I/R组和I/R+VSD组之间无显著性差异(t=1.446，P=0.166和t=1.333，P=0.263)。见表2。

表2 外周动脉血中血气值的变化

与假手术组相比：*P<0.05，**P<0.01

讨论

挤压伤是多发伤的常见伤[9]，而缺血再灌注损伤是骨骼肌继发损伤的主要原因[10]。有研究证实[11-12]，长时间能量缺乏会导致线粒体肿胀和细胞坏死，迫使机体采取糖酵解应激代谢为细胞供能[13]，其中HK2、PFK1和PKM1是其限速酶，而PDK4则可通过磷酸化限制PA的完全氧化，经LDHA转化成为LA以保证ATP的合成[14]。而组织中LA/PA比值、外周血中的pH值和AG值则可以反映局部和全身代谢性酸中毒的程度。

本实验结果显示：(1)糖酵解关键酶：与假手术组比较，I/R组和I/R+VSD组在实验结束后的糖酵解关键酶均显著性升高，证实缺血缺氧可上调酶表达，利于应激状态下为细胞供能；而I/R+VSD组酶的上调更明显；(2)糖酵解相关酶：与假手术组比较，I/R组和I/R+VSD组在再灌注前和实验结束后LDHA和PDK4表达显著性升高，而I/R+VSD组的表达更高提示负压可以促进上述酶的表达；(3)局部和全身酸中毒指标：①组织内：与假手术组比较，I/R组和I/R+VSD组PA、LA和LA/PA比值在实验结束后均显著性增高，提示酸性代谢产物随着糖酵解增多，堆积在组织内形成局部酸中毒；而I/R+VSD组在实验结束后上述值均显著性降低，可能与VSD技术改善局部循环加快转运有关；②外周血：与假手术组比较，虽然I/R组和I/R+VSD组pH值、AG值在处死前有显著性变化，但是I/R组和I/R+VSD组之间差异无统计学意义，这与全身强大的酸碱平衡调节有关。

综上，VSD技术通过上调糖酵解酶的表达，改善应激状态时细胞的能量代谢和供给，减少了局部酸中毒和pH反常的发生，对机体起到保护作用。本研究为今后通过调节负压吸引的强度和时间以干预缺血后预处理提供了理论依据。