肺结核患者T辅助细胞、NKT细胞、NK细胞水平与疾病发展及预后的关系

李利娟

[摘要] 目的 研究肺结核患者T辅助细胞、自然杀伤T细胞（NKT细胞）、自然杀伤细胞（NK细胞）水平与疾病发展及预后的关系。 方法 选取2015年12月～2016年12月四川大学华西广安医院（以下简称“我院”）收治的肺结核病患者100例，选取同期我院体检的健康者100例;根据初诊、复诊、结核菌素情况将其分为四组（Ⅰ～Ⅳ组分别为初诊肺结核组、复诊肺结核组、结合菌素阳性健康组、结合菌素阴性健康组）。使用流式细胞仪检测四组治疗前外周血T细胞、NKT、NK细胞表达率。 结果 与Ⅲ组比较，Ⅰ组患者NKT细胞表达率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），两组T细胞及NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）;与Ⅳ组比较，Ⅰ组患者NKT细胞表达率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），两组T细胞及NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）;与Ⅰ组比较，Ⅱ组患者T细胞表达率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），但两组NKT细胞及NK 细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）;Ⅲ组及Ⅳ组在T细胞、NK、NKT细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）。Ⅰ组患者中轻症、中症及重症亚组T细胞表达率差异有统计学意义（P < 0.05），表达率：重症>中症>中轻症。三个亚组的NKT细胞及NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）。100例肺结核患者治疗后均随访6个月，2例痰菌复阳，1例病灶恶化，其余均未复发。 结论 初诊患者T细胞表达水平与健康者相当，与疾病严重程度相关。复诊患者T细胞表达率明显升高。活动性结核患者中NKT细胞表达增加。因此，NK、T细胞测定可辅助诊断活动性结核。

[关键词] 肺结核;T辅助细胞;NKT细胞;NK细胞;预后

[中图分类号] R521          [文獻标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（a）-0098-04

当结核分枝杆菌侵入人体时，可激活人体先天性及适应性免疫防御反应，反应强度与症状呈正相关[1]。一些患者感染结核分枝杆菌后立即变为活动性结核病，但大多数患者体内感染结核菌会处于终身潜伏感染状态[2]。自然杀伤细胞（NK细胞）主要参与先天性免疫，T辅助细胞主要参与适应性免疫，自然杀伤T细胞（NKT细胞）为新型的免疫细胞，主要特征为CD3和CD56双阳[3]。NKT细胞具有NK细胞及T细胞的双重表型功能，可作为先天性和适应性免疫反应的连接纽带[4]。其作用靶点为结核分枝杆菌胞壁的磷酯酰肌醇甘露糖，当NKT细胞被激活后，可分泌γ干扰素（INF-γ），抑制结核菌正常活动，并分泌具有杀伤作用的颗粒素[5]。肺结核患者免疫作用复杂，本研究探讨了肺结核患者T辅助细胞、NKT细胞及NK细胞的表达，旨在分析上述细胞对结核病诊治及预后的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年12月～2016年12月四川大学华西广安医院（以下简称“我院”）收治的肺结核病患者100例，包括61例初诊患者和39例复诊患者。所有患者均符合《临床诊疗手册（结核病分册）》[6]的诊断标准。经痰抗酸杆菌涂片检验确诊为肺结核，且人类免疫缺陷病毒（HIV）呈阴性。其中男73例，女27例;年龄17～70岁，平均（41.6±6.7）岁。另选取同期我院体检且X线胸片未见异常的健康者100例。其中56例结核菌素皮试阳性，44例阴性。根据初诊、复诊、结核菌素情况将其分为四组，各组的基本资料：①初诊肺结核组（Ⅰ组）：共61例，其中男42例，女19例;年龄19～68岁，平均（40.2±5.5）岁。根据患者的肺部病变、空洞、发热等症状，由2位医生根据《结核病的诊断标准和分类（续1）临床与X线表现》[7]将患者分为轻症、中症及重症亚组，分别有15、22、24例。②复诊肺结核组（Ⅱ组）：共39例，其中男31例， 女8例;年龄23～71岁，平均（42.6±6.0）岁。③结核菌素阳性健康组（Ⅲ组）：共56例，其中男21例，女35例;年龄21～67岁，平均（34.7±5.1）岁。④结核菌素阴性健康组（Ⅳ组）：共44例，其中男16例，女28例;年龄20～67岁，平均（38.9±6.4）岁。四组在治疗前的一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有入选者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准  ①符合结核病诊断标准，经检测证实为肺结核;②同意参与并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准  ①合并糖尿病、免疫系统相关疾病、肿瘤;②痰培养为非结核分枝杆菌;③合并严重疾病;④孕期或哺乳期妇女;⑤HIV感染者及AIDS患者;⑥未收集到完整资料。

1.3 方法

使用EPICS XL流式细胞仪（Beckman Coulter公司，美国）检测治疗前四组的外周血T细胞、NKT、NK细胞表达率。住院第1天清晨采集5 mL空腹肝素钠抗凝血，进行荧光标记，取100 μL全血与CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE抗体室温下反应20 min，OptiLyse C溶血素溶血，磷酸盐缓冲液（PBS） 洗涤重悬细胞，流式细胞仪待测。使用EPICS XL SystemⅡTM Version 3.0，分析淋巴细胞的前向散射（FS）与侧向散射（SS）细胞分群，在相应的直方图或散点图中读取CD阳性表达率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用ANOVA，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组的不同细胞表达率比较

与Ⅲ组比较，Ⅰ组患者NKT细胞表达率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），T细胞及NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）;与Ⅳ组比较，Ⅰ组患者NKT细胞表达率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），T细胞及NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）;与Ⅰ组比较，Ⅱ组患者T细胞表达率显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），NKT细胞及NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）;Ⅲ组T细胞、NK、NKT细胞表达率与Ⅳ组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 Ⅰ组中轻症、中症及重症亚组T细胞表达率比较

Ⅰ组患者中轻症、中症及重症亚组T细胞表达率差异有统计学意义（F = 154.493，P < 0.05），表達率：重症>中症>中轻症。三个亚组的NKT细胞、NK细胞表达率差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.6 治疗后随访

100肺结核患者治疗后均随访6个月，2例痰菌复阳，1例病灶恶化，其余均未复发。

3 讨论

肺结核的发生与年龄、性别、职业等因素有关[8]，绝大多数患者感染结核分枝杆菌后并不会发病，主要原因是机体受到刺激后，T细胞介导的细胞免疫会抵抗结核分枝杆菌，从而产生获得性免疫。NK细胞为先天性免疫的重要细胞。NKT细胞可增强免疫反应，在抗肿瘤、感染、治疗自身免疫性疾病、移植中起到重要作用。刺激NKT细胞会产生大量细胞因子，如白细胞介素-4（IL-4）及INF-γ等，从而起到免疫调节作用;NKT细胞同时存在NK细胞样细胞毒活性，可释放穿孔素、Fas配体等溶解靶细胞，从而起到结核分枝杆菌作用。鄢仁晴等[9]研究表明，肺结核患者NKT水平显著高于正常者，T细胞及NK细胞则无显著差异，3种细胞水平与年龄、性别等均无显著相关性，因此NKT可作为结核病活动性判断指标。研究[10]表明，NKT和NK细胞在活动性肺结核患者体内表达率高，且NKT水平显著低于正常及结核病接触者，且其水平在抗结核治疗6个月内一直较低。本研究提示，初、复诊的肺结核患者NKT细胞表达率显著高于健康者，提示肺结核患者细胞免疫异常表现为NKT细胞增加，加剧了细胞毒性效应，患者NKT细胞水平有助于辨认潜伏感染或活动性结核。结核菌素阳性健康者的结核菌相对静止，未激活NKT细胞，因此其表达与结核菌素阴性健康者类似，均水平较低[11]。但本研究中各组NK细胞表达率差异无统计学意义，与胥萍等[12]研究结果相似。

T细胞通过Th1产生INF-γ、CD8+ T细胞，释放颗粒素、穿孔素，以杀死结核菌[13-19]。本研究结果提示，初诊肺结核患者与健康者比较，T细胞表达水平相当。主要原因可能为：①本研究测定了外周血T细胞，并不能完全代表病灶局部变化;②与健康者相比，肺结核患者CD4+ T细胞水平减少，CD8+ T增加[20-23]。本研究测定CD3+ T细胞，为各亚群变化总和，与健康者相当;③发病前，初诊患者T细胞水平偏低，但本组患者均为HIV阴性，发病后T细胞增加，使之与健康者水平相当。本研究结果提示，外周血T细胞与初诊患者疾病严重程度相关，T细胞增加，疾病更严重，预后更不好，但与NKT、NK细胞均无明显相关性，提示T细胞为主要的免疫反应。与初诊患者相比，复诊患者T细胞表达率显著增加，可能是由于已致敏细胞反复暴露于病原菌，激发了强烈增生反应，提示复诊肺结核患者免疫反应可能与T细胞所有亚群相关。T细胞检测有助于了解患者是否复发。

综上所述，T细胞、NKT细胞是细胞免疫重要组成部分，可诱导结核分枝杆菌特异性免疫反应。初诊患者T细胞表达水平与健康者相当，并与疾病严重程度相关。复诊患者T细胞表达率明显升高[24-25]。活动性结核患者中NKT细胞表达增加。因此，NKT细胞测定可辅助诊断活动性结核。本研究测定的细胞均为外周血细胞，与真实的病灶细胞可能存在差异。NKT细胞在发病不同阶段的免疫效应及表达率的诊断意义及其与不同疾病的关系尚需进一步的研究。

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（收稿日期：2018-07-11  本文编辑：王   蕾）