实时荧光定量聚合酶链反应法监测慢性髓系白血病外周血 BCR-ABL 融合基因水平的价值研究

陈喜填 夏维林 郑小玲 吴桂香

[摘要]目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法监测慢性髓系白血病（CML）外周血 BCR-ABL融合基因水平的价值。方法 选取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例，应用qRT-PCR法检测患者的BCR-ABL融合基因水平，并监测不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平，动态监测不同BCR-ABL融合基因水平组患者伊马替尼的治疗效果及无病生存期（DFS），患者治疗前后的BCR-ABL转录水平变化。结果 急变期患者的BCR-ABL转录本水平明显高于加速期和慢性期，加速期患者的BCR-ABL转录本水平明显高于慢性期，组间两两比较差异均有统计学意义（F=4.68，P=0.00）。疗效满意方面：低水平组与中水平组患者比较，差异无统计学意义（P>0.05），但两组均明显高于高水平组，差异有统计学意义（P<0.05）;中位DFS方面：BCR-ABL融合基因低水平组患者的中位DFS明显长于中水平组、高水平组，中水平组的中位DFS明显长于高水平组，组间两两比较差异均有统计学意义（F=36.15，P=0.00）。伊马替尼靶向治疗第3、6、12个月后的BCR-ABL转录本水平均明显低于治疗前（P=0.00）;通过伊马替尼靶向治疗，患者的BCR-ABL转录本平明显降低，但前6个月的下降幅度最明显。结论 qRT-PCR技术可准确地监测患者外周血BCR-ABL融合基因水平，有利于辅助CML患者疾病的诊断和病情分期，同时，通过对CML患者不同时期外周血BCR-ABL 融合基因水平的动态监测有利于准确评估患者的治疗效果和预后，对CML患者治疗方案的选择具有重要指导意义。

[关键词]实时荧光定量聚合酶链反应;慢性髓系白血病;外周血;BCR-ABL融合基因

[中图分类号] R733.72          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）1（a）-0011-05

慢性髓系白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）是临床常见的造血干细胞恶性肿瘤疾病，其发病机制为22号染色体的长臂与9号染色体的短臂相互易位t（9;22）（q34;q11）形成特征性Ph染色体，分子水平表现为BCR-ABL融合基因形成，并通过BCR-ABL蛋白导致CML发病。CML起病缓慢，其病程可分为无症状期、慢性期（chronic phase，CP）、加速期（accelerated phase，AP）和急变期（blastic phase，BP），随着病情发展，患者可出现脾大、发热、贫血、出血、胸骨压痛等临床症状[1-3]。目前，CML的临床治疗中，靶向药物治疗得到快速发展，显著提高了CML患者的临床疗效，延长了其无病生存期（disease free survival，DFS），其中，选择性酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼通过与 BCR-ABL激酶上的 ATP位点竞争性结合，抑制其酪氨酸激酶活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物磷酸化水平，从而特异性地抑制 BCR-ABL阳性细胞的增生并诱导其凋亡，从而发挥治疗作用。但近年来，CML患者对伊马替尼出现耐药性的报道不断增多，部分CML患者BCR-ABL融合基因水平再度升高，并出现加速或急变为急性白血病而死亡[4-5]。积极监测CML患者的病情变化，及时调整治疗方案，降低患者耐药性和肿瘤的复发成为临床关注的焦点。故动态监测 BCR-ABL 融合基因水平对 CML 的疗效及预后的判断尤为重要。临床研究显示[6-9]，CML患者外周血BCR-ABL融合基因水平与患者不同疾病分期具有显著相关性，提示可以通过患者外周血BCR-ABL融合基因水平监测其病情的进展和变化，但目前国内而关于CML患者外周血 BCR/ABL 融合基因水平在监测CML疾病进展情况方面的应用较少报道，且尚需临床数据加以验证。我院自2010年开始，已经开展包括 BCR-ABL 融合基因在内等白血病相关项目的检测，目前BCR-ABL融合基因水平的监测采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法，结果准确可靠。本研究就qRT-PCR法监测慢性髓系白血病外周血BCR-ABL融合基因水平的临床价值展开研究，旨在为临床提供参考。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2016年3月～2017年6月我院血液科收治的CML患者35例。纳入标准：①入院经骨髓细胞形态学、染色体核型分析以及融合基因检测等确诊为CML，参照2016年版《NCCN白血病防治指南》相关诊断标准[7];②既往未进行相关化疗、靶向药物治疗;③预计生存期>12个月;④患者对本研究内容知情并自愿参加。排除标准：①诊断类型白血病的患者;②合并严重的心、脑、肝、肾等实质性器官疾病的患者;③对本研究药物过敏者;④机体状况较差，不耐受化疗、靶向治疗的患者。本研究经我院医学伦理委员会批准进行。35例患者中，男21例，女14例;年龄17～74岁，平均（48.62±6.15）歲;疾病分期：慢性期29例，加速期4例，急变期2例。根据患者外周血BCR-ABL融合基因水平将患者分为低水平组（BCR-ABL≤10.00%）共11例，中水平组（10.00%50.00%）共8例。

1.2方法

所有患者均于我院进行伊马替尼靶向药物治疗，并借助武汉康圣达检验中心检测患者BCR-ABL融合基因水平，分别于治疗前、治疗后第3、6、12个月各检测1次患者外周血BCR-ABL融合基因水平。患者出院后进行密切随访，记录患者疾病复发或死亡时间。

1.2.1仪器与试剂  qRT-PCR仪采用美国伯乐CFX96，细胞裂解液采用TRhol试剂（美国Invitrogen公司），白细胞分离液采用人淋巴细胞分离液（天津美德太平洋科技有限公司），融合基因定量检测试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司。

1.2.2检测方法与步骤  采用qRT-PCR法检测患者的BCR -ABL转录本水平，具体步骤如下。①RNA提取：抽取患者空腹静脉血5 ml置于EDTAK2抗凝管中，混匀，加入人淋巴细胞分离液分离白细胞，加入TRhol试剂裂解白细胞，经氯仿萃取出核酸，并利用异丙醇沉淀提取RNA。②RT-PCR反应：将RNA反应管、DEPC-H20反应管、对照品和标准品反应管置于qRT-PCR仪中进行扩增，循环参数：45℃，20 min;95℃，5 min;95℃，15 s;58℃，60 s;循环45次。设立阳性对照和阴性对照，内参基采用ABL。③计算标准曲线：利用标准品qRT-PCR反应扩增的结果制作出标准曲线。④计算样本BCR-ABL水平：通过样本Ct值和标准曲线计算出样本起始BCR-ABL值和ABL值，选取ABL≤38的样本，根据以下公式计算BCR-ABL水平。BCR-ABL（%）=（BCR-ABL拷贝数/ ABL拷贝数）×100%。上述各项操作和步骤均按照仪器和试剂盒说明严格规范操作。

1.3观察指标

①不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平;②不同BCR -ABL融合基因水平组患者伊马替尼的治疗效果及预后;③患者治疗前后的BCR-ABL转录水平变化。

1.4疗效标准

根据患者治疗后血象各项指标变化、Ph+细胞水平以及BCR-ABL水平将患者的临床疗效分为以下几点。①血液学缓解（complete hematologic remission，CHR）：外周血白细胞（white bloodcell，WBC）≤10×109/L，WBC分类正常，血小板<450×109/L，无髓外白血病浸润，无幼稚粒细胞，维持4周;②部分细胞遗传学缓解（partial cytogenetic remission，PCyR）：Ph+细胞≤35%和（或）BCR-ABL≤10%;③完全细胞遗传学缓解（complete cytogenetic response，CCyR）：少检查20个核分裂象，Ph+细胞为0和（或）BCR-ABL<1%;④分子学缓解（major molecular response，MMR）：BCR-ABL<0.1%。评定标准参照参照中国2013年版CML治疗指南。

疗效满意为3个月达到CHR和PCyR，6个月达到CCyR，12个月达到MMR;疗效警告为3个月BCR-ABL>10%和（或）Ph+细胞36%～95%，6个月BCR-ABL 1%～10%和（或）Ph+细胞1%～35%，12个月BCR-ABL为0.1%～1%;治疗失败为3个月未达到CHR和（或）Ph+细胞100%，6个月Ph+细胞>35%和（或）BCR-ABL>10%，12个月Ph+细胞≥1%和（或）BCR-ABL>1%。

1.5统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验和方差分析;计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 不同疾病分期患者BCR-ABL转录水平的比较

急变期患者的BCR-ABL转录本平为（97.93±2.16）%，明显高于加速期的（86.35±5.37）%和慢性期的（30.28±15.92）%，加速期患者的BCR-ABL转录本平明显高于慢性期，组间两两比较差异均有统计学意义（F=4.68，P=0.00）。

2.2不同BCR-ABL融合基因水平组患者伊马替尼治疗效果及预后的比较

疗效满意方面：低水平组与中水平组患者比较，差异无统计学意义（P>0.05），但两组均明显高于高水平组，差异均有统计学意义（P<0.05）;中位DFS方面：低水平组患者的中位DFS明显长于中水平组、高水平组，中水平组的DFS明显长于高水平组，组间两两比较差异均有统计学意义（F=36.15，P=0.00）;三组患者中共有5例患者在伊马替尼治疗第3个月后无法达到CHR，通过改用其他合适的治疗方案治疗第12个月后，4例患者达到MMR（表1）。

2.3 CML患者治疗前后BCR-ABL融合基因水平的比较

伊马替尼靶向治疗前患者的BCR-ABL融合基因平均水平为（88.464±21.567）%，治疗后第3、6、12个月分别为（9.673±3.257）%、（2.482±0.716）%、（0.043±0.002）%;治疗后第3、6、12个月的BCR-ABL融合基因水平均明显低于治疗前（P=0.00）;通过伊马替尼靶向治疗，患者的BCR-ABL转录本平明显降低，但前6个月的下降幅度最明显（图1）。

3讨论

CML起源于多能干细胞的髓系恶性增生，患者22号染色体的长臂与9号染色体的短臂发生相互易位，形成特征性Ph染色体，从而产生BCR-ABL融合基因，主要为b3a2和b2a2两种转录本形式。研究显示[10-12]，95%以上的CML患者为BCR-ABL阳性，BCR-ABL融合基因通過转录BCR-ABL蛋白，可持续激活并增强胞质多种酪氨酸激酶的活性，从而扰乱了细胞内正常的信号传导途径，并启动细胞增殖和生存的信号联级反应，抑制细胞凋亡的发生。因此，BCR-ABL融合基因的水平对CML患者病情的发展具有重要影响， 在CML患者疾病分期、疗效评价、病情预后判断等方面具有重要意义[13-14]。

qRT-PCR技术是在传统PCR反应体系中加入荧光化学物质，并通过荧光信号实时监测整个PCR进程和产物总量，最后通过标准曲线对待测样品的模版进行定量分析的方法。与传统PCR技术相比具有如下优势[15-18]：①通过荧光信号强度的检测可以记录每次循环扩增产物的总量，有效解决了传统PCR只能终点进行定量检查的局限;②Ct值的重现性好，Ct值一般设定在PCR反应刚进入指数扩增期，此时微小误差尚未放大，得到的Ct值较为恒定;③模板的Ct值与起始模板的拷贝数存在线性关系，通过标准曲线可对样品进行准确定量测定。

RT-PCR于1988年首次应用于CML的BCR-ABL融合基因水平检测，其准确性得到临床广泛认可，我院自2010年已经开展包括BCR-ABL融合基因在内等白血病相关项目的检测，目前BCR-ABL融合基因水平的监测采用qRT-PCR法，结果准确可靠[19-20]。本研究采用qRT-PCR法对35例CML患者BCR-ABL融合基因进行检测，结果显示，从慢性期到急变期，患者的BCR-ABL转录本平不断升高，可见BCR-ABL融合基因水平与CML患者病情的程度具有明显相关性，BCR-ABL融合基因水平越高，患者的病情越重，因此BCR-ABL水平在CML诊断和疾病分期中具有较高的准确性。通过伊马替尼治疗后，不同BCR-ABL水平组患者的疗效和临床预后具有明显差异，其中低水平组和中水平组患者的疗效满意率较高，患者的DFS更长，而高水平组患者的疗效满意率底，DFS较短，由此可见，BCR-ABL水平与患者的临床疗效和预后具有明显相关性，可有效指导患者治疗方案的选择、评估患者的治疗效果以及预测患者的预后情况。通过动态监测患者治疗前、治疗后第3、6、12个月的外周血BCR-ABL融合基因水平，結果显示，经过伊马替尼靶向治疗后第6个月，患者BCR-ABL转录本水平明显低于治疗前，其下降幅度前6个月最为显著（P<0.05）;本研究中5例患者在伊马替尼治疗后第3个月后仍然无法达到CHR，BCR-ABL转录本水平>10.00%，通过检测其BCR-ABL突变情况，改用合适的酪氨酸激酶抑制剂治疗12个月后，4例患者达到MMR。因此，在利用伊马替尼治疗CML患者过程中，可通过动态监测患者外周血BCR-ABL融合基因水平，发现患者治疗第3个月以后，若其BCR-ABL转录本水平≤10.00%，或治疗第12个月时BCR-ABL转录本水平≤1.00%，此时可维持当前伊马替尼剂量，否则，应增加剂量或改用其他合适的酪氨酸激酶抑制，从而更有效地实现CML患者不同时期的精准治疗，提高患者的长期无病生存率。

本研究不足之处：本研究样本数较少，仅35例，实验数据可能存在较大误差，有待进一步扩大样本数量，以缩小实验误差。

综上所述，qRT-PCR技术可准确监测患者外周血BCR-ABL融合基因水平，有利于辅助CML患者疾病的诊断和病情分期，在CML的临床治疗中，通过对CML患者动态监测CML患者外周血BCR-ABL融合基因水平可及时、准确地评估患者的临床疗效，及时发现其病情变化并调整其治疗方案，对实现CML患者不同时期的精准治疗、提高其DFS具有重要作用。

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