基因甲基化在宫颈癌中的研究进展

李桐，张灿，宋芳，王建东#

1首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科，北京 100006

2安徽同科生物科技有限公司，安徽 六安 237300

宫颈癌是最常见的三大妇科肿瘤之一，也是女性第二大常见的恶性肿瘤[1]。目前普遍认为，高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）持续感染是宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelialneoplasia，CIN）发展为恶性肿瘤的直接原因。乳头瘤病毒（papilloma virus，PV）是一种可以感染爬行类、鸟类和哺乳类等脊椎动物的小型双链DNA病毒[2-3]。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）主要是通过感染皮肤和黏膜鳞状上皮的基底细胞先引起微小磨损而后产生损伤。大部分HPV可被宿主免疫系统清除，患者并无症状或仅有较小损伤，只有某些特定的HPV产生持续性感染，开始是以环状DNA方式自我复制，随着病情进展，有些HPV整合到宿主细胞DNA中，造成宿主细胞异常分化并导致癌变[4]。HPV基因组是一个8000 bp左右的双链环状DNA，包含3个功能区域：早期蛋白编码区（E1～E7）、晚期蛋白编码区（L1和L2）和长控制区（long control region，LCR）[5]。早期蛋白编码区E1～E2参与HPV基因组的复制和转录，晚期蛋白编码区L1和L2及其包裹的病毒DNA为基因转录复制调控区，晚期蛋白编码区编码组成病毒衣壳的结构蛋白，L1、L2蛋白分别是病毒的主要和次要衣壳蛋白[6]。LCR作为调控区域，与E2蛋白结合调控E6和E7基因的表达[7]。根据感染能力，可将HPV分为HR-HPV和低危型HPV（low-risk HPV，LR-HPV），HR-HPV的主要致癌基因是E6和E7[8]。E6和E7蛋白参与众多致癌过程，例如维持细胞增殖、逃避细胞生长抑制、造成基因组不稳定和突变、阻止细胞凋亡、促进细胞迁移和侵袭、诱导血管生成等过程[9]。

表观遗传学是指非基因序列改变导致的基因表达水平的变化。常见的表观遗传学改变有DNA甲基化、组蛋白乙酰化/去乙酰化、染色体重塑、染色体失活、基因组印记、非编码RNA的调控等。研究表明，表观遗传学修饰将会影响细胞生长、分化、凋亡、转化等与肿瘤相关的生物学过程[10]。DNA甲基化是目前研究最清楚、最重要的表观遗传修饰形式。在哺乳动物体细胞中，DNA甲基化是在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸聚集的DNA区域称为CpG岛，该区域平均长度为10 000个碱基对，G+C碱基的含量至少占50%，通常位于基因的5'调控区。大约60%的人类基因启动子与CpG岛相关，并且呈非甲基化状态，约6%人类基因启动子区域的CpG岛在早期发育和分化的细胞中以组织特异性方式甲基化，介导基因转录沉默[11-12]。已有研究揭示了DNA甲基化可通过不同机制调控基因表达：①可促进与甲基化CpG结合蛋白的结合能力，募集组蛋白修饰和染色体重塑复合物至甲基化的CpG位点，从而介导基因的转录抑制[13]；②胞嘧啶甲基化也可以通过阻断转录激活因子结合到相关DNA序列上，直接抑制转录[14]；③在哺乳动物DNA中大多数5-甲基胞嘧啶在重复序列中被发现，这种DNA甲基化在防止基因易位、保护染色体完整性中发挥着重要作用[15]。在肿瘤细胞中发现很多基因的CpG岛发生甲基化，主要包括肿瘤抑制基因和细胞周期相关基因。由病毒诱导的肿瘤细胞中也发现了DNA甲基化改变，肿瘤相关病毒可以编码影响DNA甲基化的致癌蛋白，从而改变宿主和病毒基因的表达。本文就近年来宫颈癌中DNA甲基化改变及其致癌机制的研究进展作一综述，以期更好地了解宫颈癌的发生发展过程，进一步推进宫颈癌的防治。

1 宫颈癌变中宿主DNA甲基化

在宫颈癌中，异常DNA甲基化包括低甲基化和高甲基化两种模式。低甲基化一般发生在基因的启动子区域，已发现主要有STK31、COL17A1和核糖体DNA三个基因。研究表明，在HPV16/18感染的宫颈癌细胞系中STK31基因启动子区域出现低甲基化，并诱导了HPV16 E6/E7的整合[16]。另有研究发现，宫颈癌细胞中COL17A1基因的启动子区域发生低甲基化，增加了宫颈癌细胞的转移和侵袭能力，提示COL17A1基因启动子的甲基化状态可用于预测患者预后，改变COL17A1基因启动子甲基化状态可能是预防宫颈癌转移的一种新策略[17]。

在CIN和宫颈癌组织中，DNA高甲基化较为常见，且宫颈癌组织中DNA甲基化水平高于CIN和正常宫颈组织，表明甲基化水平升高与宫颈癌的发生密切相关[16]。研究发现，CDKN2A转录起始位点下游区域的DNA甲基化可导致p16（INK4a）/p14（ARF）表达水平增加，这在宫颈早期病变中具有重要作用[18]。SALL3是一种肿瘤抑制基因，HPV感染可介导SALL3基因启动子区域高甲基化，诱导SALL3的抑癌功能失活，从而促进宫颈癌的发生[19]。研究表明，γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）基因甲基化在宫颈癌、CINⅠ级、CINⅡ～Ⅲ级及正常宫颈组织中的发生率分别为34.9%、13.0%、15.4%及4.7%。另外，在发生甲基化的宫颈癌组织中，IFN-γmRNA的表达水平低于未发生甲基化的宫颈癌组织；在发生甲基化的CINⅡ～Ⅲ级组织中，IFN-γmRNA的表达水平明显低于未发生甲基化的CINⅡ～Ⅲ级组织[20]。宫颈活检发现，细胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM 1）/T淋巴细胞成熟相关蛋白（T-lymphocyte maturation-associated protein，MAL）基因甲基化程度随着病变严重程度的增加而增加，尤其在CINⅢ级和宫颈癌中CADM 1/MAL的甲基化程度最高[21]。研究表明，宫颈癌、CINⅢ级及CINⅡ级组织中LINE1、HS3ST2、CCNA1、EPB41L3、EDNRB、LMX1、DPYS、PAX1基因的甲基化水平均高于正常宫颈组织和CINⅠ级组织[22-24]。研究发现，死亡相关蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）启动子甲基化状态与宫颈病变的分级呈正相关（P＜0.05），DAPK1联合O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT）基因、MGMT联合维甲酸受体β（retinoic acid receptor beta，RARB）基因、DAPK1联合RARB基因等甲基化均与宫颈病变的分级呈正相关（P＜0.05）[25]。宫颈癌组织中Keap1基因启动子CpG岛发生高甲基化可导致kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（kelchlike ECH-associated protein 1，KEAP1）的表达水平降低，核转录因子红细胞系相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）的表达水平升高，从而促进肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭，抑制肿瘤细胞凋亡[26]。肿瘤抑制基因LDOC1在宫颈癌细胞系中表达沉默，对启动子的甲基化情况进行分析，结果发现LDOC1启动子发生高甲基化导致LDOC1表达沉默，而这一现象可以通过DNA甲基转移酶抑制剂得到恢复，表明LDOC1可能成为宫颈癌的潜在分子标志物[27]。TSLC1是一种肿瘤抑制基因，研究发现TSLC1基因启动子甲基化可能是宫颈癌发生的早期事件，TSLC1可作为宫颈癌早期的敏感标志物，为其预防提供依据[28]。Kabekkodu等[29]研究表明，在宫颈癌发生过程中，DOC2B基因启动子高甲基化和基因表达沉默是一个早期且高频事件，DNA启动子甲基化可导致其表达水平降低，促进克隆形成和细胞增殖，同时发现DOC2B基因启动子区域甲基化抑制了蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）和胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2信号通路。由此可见，这些基因启动子甲基化对于宫颈癌的临床分期和肿瘤分级具有重要意义。

2 宫颈癌变中HPV基因甲基化

HPV基因组发生甲基化能够阻止其被清除，从而维持持久的感染状态。HPV基因组甲基化在宫颈癌的发生过程中具有重要作用。目前，有关HPV中L1、L2、LCR区域CpG位点甲基化的研究最多，这些区域的甲基化与宫颈癌和CIN的发生具有密切关系。HPVL1基因甲基化是宫颈组织发生恶变的危险因素。研究表明，HPV16L1基因甲基化与恶性肿瘤的发生密切相关，利用甲基化敏感性高分辨率熔解（methylation-sensitive high resolution melting，MS-HRM）曲线检测HPV16L1基因甲基化可能成为检测HPV16阳性的一种有效方法，可以识别出具有侵袭性恶性肿瘤的高风险患者，同时发现HPV16L1基因甲基化可影响E6、E7mRNA的表达[30-31]。HPV16L1、L2和E5基因CpG位点甲基化可成为诊断HPV16阳性的CINⅡ级病变的生物 标 志 物[32]。 HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV51和HPV58的L1和L2基因的CpG位点异常甲基化与CIN发生的早期阶段有关，可成为宫颈恶性瘤变的生物标志物[33-34]。另有研究发现，年轻女性中HPV16L1、L2甲基化与宫颈病变的分级具有弱相关性，提示HPV甲基化作为生物标志物需要考虑年龄因素[35]。

在宫颈癌中，甲基化改变不仅发生在DNA水平，还发生在RNA和蛋白质水平。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是一种普遍存在且保守的RNA修饰，通过影响mRNA的剪接、运输、定位、传导和翻译参与细胞分化、代谢、免疫耐受和神经信号传导等生物学过程[36]。目前有关m6A在宫颈癌中作用的研究较少，然而非编码RNA的甲基化调控在宫颈癌发生发展中的作用也是不可忽视的。研究发现，宫颈癌中微小RNA（m icroRNA，m iRNA）-9前体启动子的高甲基化导致miRNA-9表达水平下调，从而削弱了对白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路的抑制作用[37]。HPV16E6参与miRNA-23b启动子甲基化调控，通过下调miRNA-23b的表达水平，从而增强肝细胞生长因子受体（hepatocyte grow th factor receptor，HGFR，也称 c-met）的活性，诱导宫颈癌细胞凋亡[38]。研究表明，过表达的浆细胞瘤转化迁移基 因 1（plasmacytoma variant translocatin 1 gene，PVT1）可促进宫颈癌细胞增殖和迁移，其作用机制为PVT1结合并募集果蝇zeste 2多梳抑制复合物2亚基增强子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive repressive complex 2 subunit，EZH2）到miRNA-200b的启动子区，增加了组蛋白H3K27在miRNA-200b启动子区的甲基化水平，从而抑制miRNA-200b的表达[39]。

3 HPV与宿主DNA 甲基化的关系

HPV和宿主DNA甲基化对CIN和宫颈癌的发生具有重要作用，同时HPV和宿主DNA甲基化可互相调控，这种调控作用在宫颈癌的发生过程中也发挥重要作用。甲基化基因可成为预防和治疗宫颈癌的有效靶点。HS3ST2和CCNA1基因的高甲基化与HPV16和HPV18感染的宫颈鳞状上皮内病变和宫颈癌的发生率呈正相关（P＜0.05），甲基化阳性的宫颈组织中HS3ST2和CCNA1基因的表达水平均低于甲基化阴性的宫颈组织，表明HS3ST2和CCNA1基因可能在HPV诱导的宫颈癌中发挥重要作用，具有特异性高甲基化基因的患者更有可能发展为侵袭性宫颈癌[40]。另一项研究发现，HPV16感染的宫颈鳞状细胞癌中表皮生长因子受体（epidermal grow th factor receptor，EGFR）启动子发生高甲基化，感染HPV16的宫颈鳞状细胞癌中EGFR启动子的甲基化率明显高于感染其他HPV基因型的宫颈鳞状细胞癌，差异有统计学意义（P＜0.01）[41]。研究表明，宫颈癌中CpG岛高甲基化可抑制脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad，FHIT）的表达，FHIT基因甲基化与HPV16感染具有相关性，提示FHIT可能是宫颈癌预防和治疗的有效靶点[42]。另有研究表明，DLX4和SIM 1基因启动子高甲基化与HPV感染具有相关性，这些基因可能成为宫颈癌HPV感染的重要标志物[43]。PRDM 14、FAM19A4、EPB41L3基因甲基化作为HRHPV感染的阳性标志物，可为HPV感染的宫颈癌的防治提供重要靶标，其中FAM19A4、EPB41L3能够较为准确地预测宫颈癌和CINⅡ～Ⅲ级病变[44-46]。

基因甲基化可影响HPV感染，HPV感染也能够引起基因的异常甲基化。人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）启动子和近端外显子序列的甲基化程度与HPV感染的宫颈癌中hTERT的异常表达有关，这些区域的DNA甲基化检测可能为宫颈癌的早期诊断提供依据[47]。Steenbergen等[48]在人原代角质形成细胞中模拟HPV诱导转化的不同阶段，通过甲基化特异性数字染色体组型（methylation specific digital karyotyping，MSDK）分析发现了新的DNA甲基化，包括FAM 19A4、LHX1、NKX2-8、PHACTR3和PRDM 14基因，这些基因可能作为分子标志物评估HR-HPV阳性感染患者是否存在宫颈病变。HPV癌蛋白在肿瘤细胞中可以诱导特异的启动子发生甲基化，例如HPV E7蛋白可驱使CCNA1基因发生甲基化。CCNA1基因是一种抑癌基因，参与细胞周期调控，是细胞顺利通过S期和G2/M期所必须的调节因子。研究表明，在HPV感染的上皮细胞中可发现CCNA1启动子高甲基化，当HPV整合到宿主基因组中，CCNA1启动子甲基化程度进一步加深，HPV E7蛋白通过其锌指结构域CR3与DNA甲基转移酶 1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）结合，从而在CCNA1启动子区域形成蛋白复合物，诱导CCNA1启动子区域发生高甲基化，造成CCNA1表达下调，CCNA1的异常表达导致细胞无限增殖和肿瘤形成[49]。在HPV16阳性的人宫颈癌SiHa和CaSki细胞中，敲低E6的表达后，p53基因表达水平升高，抑制了DNMT1蛋白表达和启动子活性；而敲低p53的表达后可促进DNMT1蛋白表达和启动子活性；E6敲低后导致SiHa细胞生长缓慢，而DNMT1过表达可部分逆转这一现象，提示HPV16E6通过抑制p53的表达促进DNMT1蛋白表达并增加启动子活性[50]。

4 HPV和宿主DNA甲基化与HPV免疫逃逸的关系

某些肿瘤病毒可通过调控宿主DNA甲基转移酶的活性影响宿主细胞中免疫相关基因的表达，或者通过诱导基因启动子甲基化修饰抑制免疫相关基因的表达，导致这些基因的免疫功能受到抑制，从而破坏宿主免疫系统对病毒的攻击，实现病毒在宿主内的免疫逃逸，当病毒发生免疫逃逸后会进行持续感染，病毒引起的免疫系统的损伤导致肿瘤细胞逃逸抗肿瘤免疫系统的监视，从而导致肿瘤的发生[51]。干扰素-κ（interferon-kappa，IFN-κ）介导的HPV DNA甲基化修饰对免疫基因的表达具有调控作用。研究发现HPV16E6而非E7诱导IFN-κ启动子甲基化，从而导致IFN-κ的表达水平降低[52-53]。在HPV16阳性的CIN和宫颈癌中IFN-κ几乎不表达，在HPV16阴性的正常宫颈组织中IFN-κ呈高表达，表明HPV16干扰了IFN-κ的表达，促进了HPV在宿主细胞中的持续感染[52]。CXC趋化因子配体14（C-X-C motif chemokine ligand 14，CXCL14）可以抑制血管生成，直接募集免疫细胞如树突状细胞、自然杀伤细胞和T细胞等，在多种肿瘤中具有抗肿瘤活性[54-57]。研究报道，HPV16E7通过诱导CXCL14启动子甲基化显著下调其表达，从而达到逃逸宿主免疫监视的作用，CXCL14表达水平升高后能够增加自然杀伤细胞、CD4+T和CD8+T细胞对肿瘤引流淋巴结的浸润能力，诱导免疫细胞的趋化性[55-56]。还有研究发现，HR-HPVE7通过诱导人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-E启动子甲基化下调其表达，HLA-E是HLA中非经典的HLA-Ⅰ类分子，HLA-E呈递的病毒抗原可促进CD8+T细胞的杀伤活性[57]。研究表明，HR-HPVE7可诱导HLA-E启动子甲基化导致其表达下调，抑制其将病毒抗原呈递给CD8+T细胞，从而使病毒逃逸宿主的免疫监视，得以持续感染，继而导致HPV感染相关肿瘤的发生[58]。

5 HPV和宿主DNA 甲基化在宫颈癌防治中的应用

目前HPV检测是筛查宫颈癌和CIN的重要手段。研究表明，基因的甲基化状态检测可为诊断CINⅡ级及以上的宫颈病变提供证据[59-60]。在CINⅡ级及以上宫颈病变的诊断中，PCDHA4和PCDHA13甲基化检测与HPV基因检测具有相似的灵敏度，但前者的特异度更高[59]。PAX1基因甲基化对亚洲人群宫颈癌具有潜在的诊断价值，在宫颈刮片中对PAX1甲基化和HPV基因进行平行检测较单独HPV基因检测的准确度更高[61]。焦磷酸测序结果证实，DAPK1、RARB、WIF1和SLIT2基因是宫颈癌患者中甲基化异常的常见靶点，相较于单独应用HPV筛查宫颈癌，HPV联合上述4种基因甲基化水平的检测能有效提高筛查宫颈癌的特异度，同时甲基化改变可能发生在宫颈癌早期，可为宫颈癌的早期筛查提供重要证据[62]。研究显示HPV16L1/L2区域中DNA甲基化程度与宫颈病变的分级有关，HPVE2区域和L1/L2区域中DNA甲基化程度在核分裂患者中显著增加，对L1/L2区域CpG的第5600和5609位核苷酸进行甲基化评估，可获得正常样品和异常核分裂样品的最佳分离[63]。上述基因的甲基化有望成为宫颈癌筛查的辅助生物标志物。

研究表明，顺铂和5-氮杂胞苷可通过对肿瘤相关基因ESR1、BRCA1、RASSF1A、MLH1和MYOD1启动子去甲基化而引发细胞毒性、抑制细胞生长[64]。在宫颈癌患者中，TNFRSF10C和TNFRSF10D启动子高甲基化，在癌前病变中也可检测到TNFRSF10C甲基化，提示这种变化是宫颈癌发生的早期事件。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）及其受体诱导的凋亡作用与宫颈癌细胞系中TNFRSF10C和（或）TNFRSF10D的下调有关，TNFRSF10C和（或）TNFRSF10D的下调可与化疗药物协同发挥作用，提示这些基因失活在体外凋亡通路中发挥关键作用[65]。上述研究表明甲基化调控为研究新的治疗靶点提供了新思路。

6 小结与展望

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，HRHPV持续感染是宫颈癌发生的主要危险因素。虽然近年来宫颈细胞学筛查和HPV疫苗的应用使宫颈癌和癌前病变得以早期被发现和治疗，但目前仍缺乏有效的监测指标且其分子机制尚未完全清楚。HPV基因组甲基化和HPV对宿主DNA甲基化的调节作用可为HPV致癌机制和免疫逃逸机制提供更深入的理论依据。甲基化修饰基因不仅可作为宫颈癌早期诊断、疾病进展和预后的潜在标志物，还可以通过调控甲基化状态制订有效的治疗策略，对治疗宫颈癌具有深远的指导意义。