PD-1/PD-L1抑制剂及其生物标志物在食管鳞状细胞癌治疗中的研究进展△

孙佳琦，黄俊星

1南通大学医学院临床系，江苏 南通226001

2泰州市人民医院肿瘤科，江苏 泰州225300

食管癌原发于食管黏膜上皮细胞，是全球范围内发病率和病死率均较高的的消化道恶性肿瘤[1]。中国是食管癌的高发国家，男性的发病率高于女性，其发病率和组织学亚型存在明显的地域分布特征[2-3]。根据病理类型的不同，食管癌分为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌。多数ESCC患者确诊时已发展为晚期或已发生转移，失去了手术的最佳机会，多采取姑息性治疗，预后较差，因此，优化的治疗策略有助于改善食管癌患者的预后。肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment，TIME）在多种肿瘤中的生物学作用和意义已被逐渐认识。近年来，随着对免疫检查点研究的不断深入，程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）/程序性死亡受体配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称 PD-L1）通路成为了肿瘤免疫治疗领域的热点。PD-1和PD-L1是重要的免疫检查点抑制剂，在肿瘤免疫逃逸中起重要的作用。激活PD-1/PD-L1信号通路能够抑制T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）的功能，而针对这一信号通路的抑制剂能够阻断PD-1与PD-L1的结合，恢复T淋巴细胞的功能，从而增强机体的免疫应答能力。

1 PD-1/PD-L 1信号通路及抗体

PD-L1是免疫球蛋白超家族的重要成员，是与细胞凋亡相关的蛋白，于20世纪90年代在对T淋巴细胞杂交瘤的凋亡研究中首次被发现。B7蛋白家族在部分T淋巴细胞的活化和免疫耐受的动态平衡中起着重要的调节作用。B7同源物1（B7 homolog 1，B7H1）也称 PD-L1，属于跨膜糖蛋白，是B7蛋白家族的成员。B7-H1与PD-1结合能够负性调节T淋巴细胞介导的免疫反应。γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）是重要的抗肿瘤细胞因子，可上调肿瘤细胞表面PD-L1的表达[4]。PD-L1与激活的T淋巴细胞表面的PD-1相结合可抑制T淋巴细胞的抗肿瘤免疫应答能力，促进肿瘤免疫逃逸的发生，从而促进肿瘤的生长[5]。然而，抗PD-L1抗体会抑制肿瘤的生长。针对PD-1和PD-L1的人源化单克隆免疫球蛋白 G4（immunoglobulin G4，IgG4）抗体的第一阶段研究为抗PD-1抗体[如纳武单抗（Nivolumab）和派姆单抗（Pembrolizumab）]被批准应用于早期实体肿瘤的治疗奠定了基础[6]。随后，抗PD-L1抗体如阿特朱单抗（Atezolizumab）、阿维鲁单抗（Avelumab）和度伐鲁单抗（Durvalumab）也陆续被批准用于多种肿瘤的治疗，而关于抗PD-1抗体药物和抗PD-L1抗体药物在ESCC中作用的临床试验也正在进行中。美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）已批准派姆单抗可单药治疗肿瘤表达PD-L1（联合阳性评分≥10分）、经1种或多种方案全身治疗后进展的复发性局部晚期或转移性ESCC[7,12]。

2 抗PD-1/PD-L 1抗体与ESCC的关系

2.1 派姆单抗

Doi等[7]进行了评估派姆单抗在PD-L1阳性晚期ESCC患者中安全性和有效性的I期临床试验，证实了派姆单抗在PD-L1阳性晚期ESCC患者中具有良好的抗肿瘤活性和安全性。此外，派姆单抗在食管癌中的抗肿瘤活性和安全性在Ⅱ期KEYNOTE-059试验[8]和Ⅱ期KEYNOTE-180试验[9]中也得到了验证。2018年，美国国立综合癌症网络（NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN）指南推荐派姆单抗用于确定存在高度微卫星不稳定性或错配修复（mismatch repair，MMR）基因缺陷肿瘤患者的二线或后续治疗，以及PD-L1阳性的食管和胃食管交界部腺癌[10]的三线或后续治疗。Kato等[11]进行的KEYNOTE-590研究探讨了派姆单抗作为晚期食管癌一线治疗药物的安全性和有效性，纳入的患者是经组织学或细胞学确诊为局部晚期不可切除或转移性的ESCC患者，该研究结果发现，派姆单抗联合5-氟尿嘧啶化疗的效果优于5-氟尿嘧啶单药化疗。

2.2 纳武单抗

Kudo等[12]进行了关于晚期ESCC患者应用纳武单抗治疗的Ⅱ期临床试验，纳入了65例未根据PD-L1的表达状态进行预先选择的食管癌患者，患者既往均接受过1次及以上的治疗，并评估了64例患者的临床疗效，总生存时间（overall survival，OS）为12.1个月，客观缓解率为17.2%（11/64）。纳武单抗在未经治疗的ESCC患者中也表现出了持久的抗肿瘤活性。随着免疫检查点抑制剂在Ⅰ～Ⅱ期临床试验中取得了良好的效果，Ⅲ期临床试验（NCT02569242）随之开展，该试验共纳入了无法进行手术的390例晚期或复发ESCC患者，并将其随机分为了纳武单抗组、紫杉醇/多西他赛组，主要研究终点为OS，结果预计将于2020年公布[13]。

2.3 卡瑞利珠单抗

卡瑞利珠单抗（Camrelizumab）（研发代号为SHR-1210）是一种选择性、人源化、高亲和力的抗PD-1 IgG4单克隆抗体。Huang等[14]首次报道了卡瑞利珠单抗在ESCC治疗中的安全性和抗肿瘤活性，研究对象为难治性晚期ESCC患者，化疗方法：静脉注射卡瑞利珠单抗60 mg，后逐渐增加剂量至200 mg和400 mg（首次注射后间隔4周，随后按每2周的计划进行治疗），直至病情进展或患者无法耐受不良反应，结果显示，患者的主要不良反应为反应性毛细血管瘤，而治疗相关的3级不良反应包括肺炎和心肌肌钙蛋白I升高。Wang等[15]的研究结果显示部分晚期ESCC患者可以从卡瑞利珠单抗治疗中获益，且认为血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）是预测卡瑞利珠单抗治疗晚期ESCC患者临床反应的潜在标志物。

3 ESCC相关抗PD-1/PD-L 1抗体生物标志物

3.1 免疫相关生物标志物

在肿瘤细胞和免疫细胞中，PD-L1是目前最常用的肿瘤免疫治疗的疗效预测性生物标志物。PD-L1阳性的TIL增多的患者对抗PD-1/PD-L1抗体的反应率增加[16]。PD-L1在ESCC等多种肿瘤中的表达水平均较高，有研究发现，PD-L1和程序性死亡受体配体2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也称PD-L2）在ESCC中的阳性表达率分别为45.5%和59.7%[17]。CD8+T淋巴细胞被称为细胞毒性T淋巴细胞，能够分泌IFN-γ，是细胞免疫的重要组成部分。PD-L1在ESCC中的阳性表达情况与CD8+T淋巴细胞数量可能有关（P=0.0157）。PD-L2在ESCC中的阳性表达率为59.7%，高于PD-L1的45.5%，且PD-L2的阳性表达与患者较差的预后有关[17]。有研究发现，PD-L1/PD-L2阳性肿瘤患者的OS明显短于PD-L1/PD-L2阴性的患者，PD-L1/PD-L2阳性是ESCC患者预后不良的独立危险因素，这一发现可能具有临床相关性，因为单独应用抗PD-L1抗体治疗后患者的应答率低于抗PD-1抗体，此外，多种PD-L1阴性肿瘤对抗PD-L1抗体的治疗有应答，提示除了PD-L1外，还有其他分子参与ESCC的PD-L1抑制轴[17]。有研究发现，PD-L2在卵巢癌、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤等肿瘤中的表达水平均较高，预示患者的预后较差[17-18]。

Kato等[19]进行了一项关于纳武单抗治疗晚期ESCC的临床试验（JAPICCTI-142422），采用流式细胞仪检测20例晚期ESCC患者的外周血T淋巴细胞表面分子和细胞因子的表达情况，分析了纳武单抗治疗后完全缓解（CR）/部分缓解（PR）与疾病稳定（SD）/疾病进展（PD）患者中白蛋白、中性粒细胞、Tim-3+、CD45RA-CD27-和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达情况，结果显示，Tim-3+CD4水平与患者的生存情况有关，认为Tim-3+可能能够作为预测晚期ESCC患者免疫治疗后临床反应和预后的标志物。该研究还发现，与SD/PD患者相比，CR/PR患者的淋巴细胞计数增多、中性粒细胞计数减少、中性粒细胞淋巴细胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）降低、白蛋白水平升高、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平降低、肿瘤标志物水平降低，提示低NLR可能也有助于预测治疗效果。

3.2 基因组相关生物标志物

肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）检测已成为一种常见的技术，其是指每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，其作为生物标志物对免疫检查点抑制剂疗效的预测作用在临床研究中得到证实[20]。TMB是筛选PD-1/PD-L1阻断治疗中潜在受益患者的生物标志物。

MMR基因负责识别和修复DNA复制和重组过程中出现的碱基错配和损害，使核苷酸顺序恢复正常。微卫星DNA是真核细胞基因组中随机出现的大量简单串联重复序列，其通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用，但是某些微卫星DNA在特定的肿瘤中容易发生微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI），即存在DNA不稳定热点区，也就是说MSI是由于MMR基因发生突变所引起的。MSI/MMR基因及MSI病灶的存在和数量可以通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）或免疫组化法进行检测[21]。通过检测MSI可间接反映MMR是否异常，因此，检测MSI可以用于肿瘤的早期筛查。2017年，FDA批准派姆单抗用于治疗具备微卫星高度不稳定性（microsatellite instability-high，MSIH）和错配修复缺陷（mismatch repair deficiency，dMMR）基因特征的无法手术或已经出现转移的实体肿瘤。Jin和Yoon[22]研究发现，10%～20%的胃食管癌患者发生MSI，MSI与非同义突变负荷以及TIL的聚集有关，且与胃肠道肿瘤对抗PD-1抗体的治疗反应有所改善有关。dMMR肿瘤的新抗原负荷较高。Le等[23]进行了一项关于派姆单抗治疗转移性晚期肿瘤疗效的研究，结果显示，dMMR肿瘤的TMB、客观缓解率、无病生存率（progressionfree survival，PFS）均高于MSI肿瘤。有研究发现，TMB与PD-L1的表达无关[24]。

在多种肿瘤中，T淋巴细胞能够特异性识别抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）表面特定的抗原肽-主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）复合物，这种抗原肽可能来自两种肿瘤抗原，一种是由T淋巴细胞不完全耐受的非突变蛋白形成的，另一种是由完全不存在于正常人类基因组中的多肽形成的，即所谓的新抗原[25]。对于大量无病毒病原学的人类肿瘤，此种新抗原完全是因肿瘤特异性DNA发生改变而产生的，从而形成新的蛋白序列。TMB高的患者产生的新抗原多，而PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的治疗效果与新抗原的负荷具有相关性，新抗原的负荷越高，PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的治疗效果越好[26]。

肿瘤新表位是存在于肿瘤新抗原表面的、决定抗原特异性的具有特殊性结构的化学基团。Huang等[14]应用抗PD-1抗体对晚期ESCC患者进行治疗，结果发现，新抗原表位标记与TMB和潜在的突变相关新抗原计数密切相关，而高计数的新抗原表位（＞4）可能是预测治疗效果的唯一标志物。该研究表明，有效的新抗原可能是抗PD-1抗体治疗食管癌的关键因素。TMB的增加将增加拥有更多突变相关的新抗原和更加有效的新抗原表位的可能性。突变负荷、新抗原和新抗原表位分析可成为ESCC患者潜在的生物标志物。此外，免疫相关的基因表达，包括T淋巴细胞功能基因、抗原呈递和干扰素-g信号等，可能是抗PD-1单抗治疗后患者临床获益的有效预测因子。

3.3 肠道微生物菌群

宿主肠道微生物菌群与免疫系统存在着密切的关系，宿主肠道微生物菌群可以通过影响肿瘤患者机体免疫系统的功能从而影响肿瘤的发生、发展，在应用PD-1/PD-1免疫检查点抑制剂的同时或之前调节肠道微生物菌群可促进免疫治疗后免疫系统的免疫应答。应用抗PD-1抗体进行免疫治疗的临床反应率与在黑色素瘤[27]患者中采集的微生物样品内反刍球菌科细菌的多样性及相对丰度有关，也与非小细胞肺癌、肾细胞癌、尿路上皮癌患者肠道中某种细菌的相对丰度有关[28]。此外，双歧杆菌被证明在体内能够增强抗PD-L1抗体的活性[29]。研究表明，肠道微生物菌群在ESCC的发生与发展中起着至关重要的作用，如牙龈卟啉单胞菌的存在与ESCC的分化和转移呈正相关，且患者预后较差。ESCC患者的不良预后也与口腔内核梭杆菌的存在有关[30]，今后需要进一步地探索肠道微生物菌群在ESCC中的生物标志性作用及其与免疫治疗之间的关系。

4 小结与展望

尽管多学科综合治疗手段不断进步，但晚期ESCC患者的预后仍不容乐观，因此，迫切需要针对晚期ESCC患者制订新的治疗策略。采用治疗性单克隆抗体抑制PD-1与PD-L1的相互作用将是治疗ESCC的一种有前途的新策略。通过探索肿瘤微环境涉及的免疫标志物以预测ESCC患者预后、指导ESCC免疫治疗已成为必然。肿瘤可通过对PD-1、PD-L1、PD-L2等免疫检查点的表达进行调控以逃避宿主免疫系统的监视。全面检测和评估影响ESCC患者预后的免疫检查点，对提高ESCC患者的治疗和管理水平具有重要意义。抗PD-1/PD-L1单克隆抗体是ESCC免疫治疗的重要药物，其结合肿瘤疫苗或放化疗治疗可能成为ESCC治疗的理想或合理策略。由于ESCC具有高频率非同义突变、放射性敏感和多种抗原肽等生物学特性，免疫检查点抑制剂对于ESCC的治疗具有重要的作用，抗PD-1/PD-L1单克隆抗体在ESCC治疗领域拥有广阔的应用前景。