合萌水提物抗炎镇痛作用的实验研究

王 娟，胡 倩，刘 铃，袁带秀，余 浩

(吉首大学 医学院，湖南 吉首416000)

合萌(AeschynomeneindicaLinn.)系一年生“水陆两栖”草本或亚灌木状植物，为豆科合萌属合萌族，中药名为梗通草，别名为田皂角、水皂角、水槐子等。民间习用其全草入药。其味甘淡、寒，入脾、胃经，具有清热利湿、祛风明目、通乳等作用，主治热淋、血淋、水肿、排泄、痢疾、目赤肿痛、关节疼痛等症状[1]。迄今为止，已从合萌的种子、叶、茎等部位分离出了多种化合物，其中包括蒽醌及其甙类，黄酮及其甙类，黄烷醇及其甙类等[2]。现代药理学研究证实合萌提取物具有抑制多种致病细菌、抗炎、镇痛和抗过敏作用[3]。本实验进一步对其抗炎、镇痛作用及其机制进行初步研究，以期为合萌的临床应用和新药开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品

合萌由植物资源与利用湖南省高校重点实验室提供，由我院中药学李春艳教授鉴定。地塞米松片，广东华南药业集团有限公司生产，批号151101；阿司匹林肠溶片，湖南新汇制药股份有限公司山产，批号150606。

1.2 动物

昆明种小鼠(清洁级)，体质量18～22 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。动物按性别分笼，饲养于空调室内，室温(22 ±2)℃，湿度(60 ± 5)%，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

1.3 主要仪器与试剂

FA2204C电子分析天平(上海平轩科学仪器有限公司)，PL-200热刺痛仪(成都泰盟)，YLS-Q耳肿打孔器(济南益延科技发展有限公司)，7-6V分光光度计(南京菲勒仪器有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒均由南京建成生物工程公司生产。

1.4 方法

1.4.1 供试样品的制备

将合萌全草500 g干燥、粉碎，过筛，水煎3次，每次30 min，合并水煎液，浓缩为1 g/mL(生药)，得到合萌水提物。

1.4.2 抗炎作用

1.4.2.1 耳廓肿胀实验

取昆明种小鼠50只,雌雄各半，采用完全随机分组法分为5组，每组10只。给药组(合萌水提物高、中、低剂量组)分别灌胃给予合萌水煎液1.5、1.0、0.5 g/kg，阳性药组灌胃给予地塞米松0.02 g/kg，空白对照组灌胃10 mL/kg蒸馏水。均每天1次，连续给药7 d，末次给药后0.5小时，在每只小鼠右耳正反面凃二甲苯0.05 mL致炎，左耳廓作为对照，1 h后，颈椎脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径8 mm打孔器在同一部位取下耳片，称重，以左右耳片质量差值表示肿胀程度，计算小鼠耳朵肿胀度以及肿胀抑制率[4]。

肿胀度=右耳片质量-左耳片质量肿胀

抑制率=(空白对照组耳肿胀度-用药组耳肿胀度)/空白对照照组耳肿胀度×100%

1.4.2.2 足趾肿胀实验

取昆明种小鼠50只,雌雄各半，分组给药同1.4.2.1，末次给药后1 h，在每只小鼠右侧足趾皮下注射1.0%角叉菜胶30 μL致炎，并于致炎后再灌胃给予相应药物1次，次日处死小鼠，剪取双后足精确称量，以右足的重量减去左足的重量作为足趾炎性肿胀度，计算小鼠足趾炎肿胀度以及肿胀抑制度[5]。

肿胀度=右后足质量-左后足质量

肿胀抑制度=(空白对照组足趾肿胀度-用药组足趾肿胀度)/空白对照组足趾肿胀度×100%

1.4.2.3 小鼠腹腔毛细血管通透性实验

取昆明种小鼠50只,雌雄各半，分组给药同1.4.2.1，末次给药后1 h，按0.1 mL/10g小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液，立即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只；20 min后处死小鼠，用5 mL生理盐水冲洗小鼠腹腔，收集冲洗液，3 000 r/min，离心15 min，取上清液于分光光度计590 nm处比色，测定吸光度值(A)[6]。

1.4.3 镇痛作用

1.4.3.1 醋酸扭体实验

取昆明种小鼠50只，雌雄各半，采用完全随机分组法分为5组，每组10只。给药组(合萌水提物高、中、低剂量组)分别灌胃给予合萌水煎液1.5、1.0、0.5 g/kg，阳性药组灌胃给予阿司匹林0.2 mg/kg，空白对照组灌胃10 mL/kg蒸馏水。末次给药后1小时，各组小鼠分别腹腔注射0.7%醋酸溶液0.1mL/10g，观察小鼠出现扭体反应的潜伏期及15 min内扭体反应的次数(以小鼠腹部凹陷、双后肢伸展为扭体反应指标),计算扭体反应抑制率[7]。

抑制率=(空白对照组扭体反应次数-给药组扭体反应次数)/空白对照组扭体反应次数)×100%

1.4.3.2 热板实验

选用昆明种雌性小鼠，热板(55±0.5)℃，观察小鼠出现舔足的潜伏期，作为痛阈指标，选择痛阈在5～30 s的小鼠50只，采用完全随机分组法分为5组。给药组(合萌水提物高、中、低剂量组)分别灌胃给予合萌水煎液1.5、1.0、0.5 g/kg，阳性药组灌胃给予阿司匹林0.2 mg/kg，空白对照组灌胃10 mL/kg蒸馏水。每组给药前重复测定痛阈值，取2次痛阈平均值作为正常痛阈值，连续给药7 d，每天1次。末次给药后30、60、90、120 min分别测定各组小鼠痛阈值，如60 s内无反应的小鼠，应立即取出，以免烫伤，其痛阈值按60 s计算[8]。实验结束后，眼眶取血，3000 r/min离心10 min，取血清检测SOD活性、MDA和NO含量。

1.5 统计学处理数据

以±S表示，利用SPSS 16.0统计软件，单因素方差分析，组间比较采用q比较。

2 结 果

2.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀作用的影响

由表1可知，合萌水提物高剂量组小鼠耳廓肿胀程度明显低于空白对照组(P<0.05)，合萌中、低剂量组小鼠廓肿胀程度与空白对照组比较无显著性差异，提示合萌高剂量能显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀。

组别剂量(g/kg)耳肿胀度(mg)肿胀抑制率(%)空白对照组—8.25±1.16地塞米松组0.022.71±0.47a67.15%合萌高剂量组1.55.14±0.96b37.70%合萌中剂量组15.88±1.0128.73%合萌低剂量组0.57.00±0.9315.15%

注：与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05

2.2 对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀作用的影响

由表2可见，合萌水提物高、中剂量均能明显缓解角叉菜胶致小鼠足跖炎性肿胀，其抑制作用随剂量的增加而增强；与空白对照组比较，具有统计学差异(P<0.05，P<0.01)。

组别剂量(g/kg)足趾质量(mg)左足右足足趾肿胀度(mg)肿胀抑制率(%)空白对照组—169.0±10.39256.5±10.4387.5±11.03地塞米松组0.02150.2±6.82184.1±10.43a37.6±6.41a57.03%合萌高剂量组1.5169.0±10.2221.0±10.7953.2±4.77a39.20%合萌中剂量组1157.8±6.81215.0±9.31b59.3±4.94b32.23%合萌低剂量组0.5157.5±14.89223.6±22.6566.1±9.4124.46%

注：与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05

2.3 对醋酸致小鼠毛细血管通透性的影响

由表3可知，合萌水提物高、中、低剂量均能明显减少伊文思蓝渗出量；与空白对照组比较，具有统计学差异(P<0.01)，提示合萌能显著抑制醋酸致小鼠毛细血管通透性。

组别剂量(g/kg)OD值空白对照组—0.267±0.029地塞米松组0.020.079±0.007a合萌高剂量组1.50.101±0.016a合萌中剂量组10.124±0.009a合萌低剂量组0.50.160±0.024a

注：与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05

2.4 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

由表4可知，合萌水提物高、中剂量均有镇痛作用，且合萌水提物的高剂量的镇痛效果与阿司匹林的镇痛效果相当(P<0.01)。

组别剂量(g/kg)潜伏期(min)扭体次数(次/15 min)抑制率(%)空白对照组—2.86±0.3557.33±7.58阿司匹林组0.25.16±0.59a28.83±3.05a49.71%合萌高剂量组1.54.67±0.65b33.50±4.01a41.57%合萌中剂量组13.89±0.7038.00±6.64b33.72%合萌低剂量组0.53.29±0.4544.33±6.1722.68%

注：与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05

2.5 对热板所致小鼠疼痛反应的影响

由表5可见，合萌水提物高、中、低剂量组及阿司匹林组在给药后均能显著提高痛阈值(P<0.01)，相同时间与空白对照组比较，合萌水提物不同剂量组及阿司匹林组在提高痛阈值方面具有统计学差异(P<0.01)。

2.6 合萌水提物对热板实验小鼠血清中SOD，MDA，NO的影响

由表6可知，与空白对照组比较，合萌水提物高剂量组和阿司匹林组均能显著降低MDA含量，提高SOD活性，并能显著抑制小鼠血清NO生成(P<0.05，P<0.01)。

组别剂量(g/kg)给药前痛阈值/(s)给药后痛阈值/(s)30 min60 min90 min120 min空白对照组—13.83±1.5415.00±2.5615.16±2.6914.67±2.6714.16±2.91阿司匹林组0.214.50±1.3839.50±2.68ac40.83±4.03ac42.16±4.14ac41.16±2.52ac合萌高剂量组1.515.50±2.4037.70±2.57ac40.16±3.91ac41.00±5.16ac40.83±2.41ac合萌中剂量组115.33±2.2836.20±2.52ac38.50±2.99ac38.60±0.68ac36.50±2.96ac合萌低剂量组0.514.83±1.7232.80±3.53ac36.00±2.70ac38.00±4.87ac35.33±2.93ac

注：与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与给药前比较，cP<0.01

组别剂量(g/kg)SOD(U/mL)MDA(nmol/mL)NO(μmol/L)空白对照组—107.6±19.1623.34±2.7594.54±21.18阿司匹林组0.2157.3±3.19b15.48±1.04a39.62±9.22b合萌高剂量组1.5151.8±9.19b16.37±1.49b45.10±8.36b合萌中剂量组1135.5±13.8619.23±2.0760.36±18.51合萌低剂量组0.5126.4±19.3819.65±1.5064.72±16.22

注：与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与给药前比较，cP<0.01

3 讨 论

炎症是机体组织对各种物理、化学、生物等损伤因子所发生的防御性反应，其局部反应主要包括红、肿、热、痛及功能障碍等[9]。事实证明，炎症反应和疼痛常常相伴而生，并互相影响。文献[10]报道，田皂角水提物可明显抑制巴豆油所致小鼠耳廓肿胀，醋酸致小鼠扭体反应。本研究结果发现，合萌水提物可抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀、角叉菜胶所致的小鼠足跖肿胀的急性炎症反应，而且其抑制作用呈量效关系；以伊文思蓝渗出量为指标的小鼠毛细血管通透性的急性炎症实验中，合萌水提物能显著抑制醋酸致小鼠毛细血管通透性伊文思蓝的渗出量，抗炎实验表明合萌具有显著的抗炎作用。热板法和醋酸扭体法镇痛实验表明，合萌水提物能延缓醋酸所致小鼠扭体的出现时间，减少扭体次数，而且呈现一定的量-效关系，剂量越大，扭体反应的潜伏期延长、次数减少，这表明合萌有抗炎性疼痛的药理活性；合萌水提物能明显延长热刺激小鼠痛阈值，表明该合萌对温度等物理因素导致的疼痛有镇痛作用。