广东省肇庆市肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性与MLST分型研究

苏乐斌 李柏生 谭海芳 朱颖梅 林凤 黎碧坚

(1 肇庆市疾病预防控制中心，肇庆 526060；2 广东省疾病预防控制中心，广州 511400)

肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae, KP)属于肠杆菌科克雷伯菌属，革兰阴性菌，是临床上最常见的条件致病菌之一，可引起肺炎、尿路感染、血流感染等一系列感染性疾病。近20年来发现，肺炎克雷伯菌对抗生素的耐药性日趋严重，产超广谱 β-内酰胺酶(ESBLsKP)及耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的陆续出现，使得肺炎克雷伯菌成为院内感染的主要致病菌[1]。同时，由高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)引起的社区性获得性肺炎克雷伯菌感染也层出不穷[2-3]，。近年来，甚至发现一些产ESBLs的hvKP和其他类型的多重耐药hvKP患者[4-5]。高毒力同时携带多重耐药性的肺炎克雷伯菌将给公共卫生的防控和临床患者的治疗带来极大的挑战。本次研究通过对广东省肇庆市2家医院收集的63株肺炎克雷伯菌临床分离株开展体外抗生素敏感性试验与MLST，及时掌握本地区肺炎克雷伯菌的耐药谱和菌群群落分布特征，有助于本地区医院加强和改进院内感染监测和控制措施，合理使用抗生素，同时也为公共卫生的防控提供技术依据。

1 材料

1.1 菌株来源

收集2017年11月—2018年4月广东省肇庆市2家医院所有从住院患者分离到的肺炎克雷伯菌，共63株，所分离菌株均来源于痰、血、中段尿等患者标本。经VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪对分离菌株进行鉴定，其中分析仪器由法国Bio-Mérieux公司生产。质控菌株分别为：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.2 主要仪器与试剂

VITEK2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析(法国Bio-Mérieux公司)，PCR仪(德国Senso Quest Labcycler公司)，革兰阴性菌药敏检测板(上海星百医药生物技术有限公司生产，货号为A-3009XS、A-4009XS)，PrimeSTAR®Max DNA Polymerase试剂(大连宝生物科技公司，货号为R045A)，血琼脂平板(广东环凯微生物科技有限公司，货号为024070)，质控菌株分别为：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.3 MLST管家基因引物

7个管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB)引物序列参照MLST数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 黏液拉丝试验

用接种环轻触血琼脂平板上过夜培养的新鲜菌落向外牵拉，重复牵拉两次。若两次均有黏液丝形成并且长度大于5mm，为黏液拉丝试验阳性菌株，即为hvKP。

2.2 药物敏感性试验

药敏试验使用商品化革兰阴性菌药敏检测板，严格按厂家说明书进行操作，并使用上海星百医药生物技术有限公司的配套软件判读最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)。

2.3 多位点序列分型(MLST)

采用水煮法粗提DNA，PCR反应体系为12.5μL PremixTaq，引物各1μL，模板1μL，无菌水10.5μL，总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性30s，相应温度(7个位点的退火温度除了gapA为60℃、tonB为45℃外，其余5个位点均为50℃)退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，一个循环[10]。取5μL PCR产物进行琼脂糖电泳，PCR产物阳性的，送测序公司测序后，将序列提交到MLST官网数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)进行比对，确定每株菌株的序列型(ST)。

2.4 测序数据分析与建树

通过在MLST官网数据库比较后，确定每株菌株的ST型，运用Bio Numerics 7.1软件进行数据处理，生产最小生成树(MST)和耐药谱图。最小生成树(MST)图中每个圆的大小代表相同ST型的数量，黑实线代表2个ST型间管家基因有3个或3个以下的差异，黑实线越粗，2个ST型间的管家基因差异越小。虚线代表示有2个ST型间管家基因有4个或4个以上的差异，虚线点越密，2个ST型间的管家基因差异越大。在种群内部可通过比较的等位基因图谱之间的联系，即紧密的相关的菌株， 其等位基因图谱是相同或相近的，可被鉴定为一个序列组(STs)，无相关性的菌株的图谱是没有关联的[6]。耐药谱图中黑色方格代表对该种抗生素耐药，灰色方格代表对该种抗生素中度敏感，白色方格代表对该种抗生素敏感。

3 结果

3.1 菌株情况

本次研究收集的63株KP全部来源于患者，年龄以50岁以上的患者占了69.84%(44/63)，检出菌株的科室以重症监护室(各类ICU)为主，占55.30%(35/63)。临床标本类型最多为痰占54.00%(34/63)，其次为血占22.20%(14/63)，中段尿占14.30%(9/63)，伤口分泌物占4.70%(3/63)，穿刺液占3.20%(2/63)，腹水占1.60%(1/63)。通过黏液拉丝试验分类，拉丝实验阳性菌株(hvKP)20株，分别来源重症监护室(各类ICU)8株占40.00%(8/20)、泌尿外科2株占10.00%(2/20)、消化内科2株占10.00%(2/20)、心内科2株占10.00%(2/20)、妇科2株占10.00%(2/20)、呼吸内科1株占5.00%(1/20)、脑病科1株占5.00%(1/20)、普外科1株占5.00%(1/20)、烧伤外科1株占5.00%(1/20)。

3.2 菌株药物敏感性试验结果

63株肺KP菌株耐药谱见图1。由于KP对氨苄西林天然耐药，20株hvKP对29种抗生素类药物绝大部分是敏感的，检出率为31.74%(20/63)，其中耐药谱为全敏感的有18株hvKP，1株hvKP(KP49)对四环素耐药，1株hvKP(KP25)对四环素、氯霉素、复方磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑耐药为多重耐药菌，该株菌株分离自PICU患者；23株KP为ESBLsKP，检出率为36.51%(23/63)，且23株ESBLsKP中大部分分离自重症监护室(各类ICU)的患者，检出率为47.83%(11/23)，其中有4株(KP09、KP10、KP22、KP13)对多黏菌素E耐药，对多黏菌素B中度敏感，且KP09、KP10、KP22均分离自同一医院，而KP13则分离自另一医院；8株KP为CRKP，耐药谱主要表现为对亚胺培南和美罗培南耐药，检出率为12.70%(8/63)，且8株CRKP中有7株分离重症监护室(各类ICU)的患者，检出率为87.50%(7/8)；剩余12株KP为多重耐药菌MDRKP，耐药谱表现为对3种或3种以上抗生素耐药，检出率为19.05%(12/63)，重症监护室(各类ICU)检出率为75.00%(9/12)。

3.3 多位点序列分型(MLST)结果

63株肺炎克雷伯菌MLST分型共发现41个ST型，其中ST37型有9株，ST11型5株，ST65型5株，ST23型3株，ST661型2株，ST1087型2株，ST1530型2株，ST2890型2株，其余ST型各1株。Bio Numerics软件用于分析最小生成树(MST)结果(图2)， STs分布比较分散，普遍存在3个或3个以上的管家基因差异，而其中较大的STs有4个，分别是STs1(由ST37单独组成)含9株产ESBLsKP，STs2(ST65、ST25、ST1135组成)含6株hvKP和1株MDRKP，STs3(由ST11和ST690组成)含6株CRKP，STs4(由ST23和ST218组成)含4株hvKP。菌株耐药谱结合MLST发现，根据耐药谱分类的4类KP都有主要的分子流行特性(图3)：hvPK以ST23和ST65为主要流行型；ESBLsKP以ST37为主要流行型；CRKP以ST11为主要流行型；其他MDRKP的ST型呈多型别分散状流行。

4 讨论

肺炎克雷伯菌是临床上常见的条件致病菌，在机体免疫力低下或长期大量使用抗生素导致菌群失调时，容易引起机会性感染。重症监护室、新生儿病房和老年病房是感染KP的高发区。hvKP除了引起肝脓肿，极易播散引起其他重要部位的转移性感染且预后较差[7]，而多重耐药KP引起院内感染暴发流行后果更严重，死亡率高达40%[1]。本次研究对广东省肇庆市两家医院的63株KP临床分离株进行了抗生素敏感性试验和MLST分型，分离株主要来源于ICU病房，以痰和血标本为主，感染人群集中在50以上的中老年人，这与其他地区KP医院感染特点类似[1]。

药物敏感性试验结果显示(图1)，63株肺炎克雷伯菌临床分离株中除了19株hvPK对常用抗生素仍是敏感外，其余44株分离株对大部分抗生素耐药比较严重，都是表现为ESBLsKP或CRKP或其他类型MDRKP，这提示本地区主要医疗机构中流行的都是具有强耐药能力的肺炎克雷伯菌，需要加强医院肺炎克雷伯菌院内感染的监测和防控。耐药谱结合MLST分析发现(图1)，9株ST37型的ESBLsKP其耐药谱存在差别，值得注意的是红色方框内的3株菌株(KP09、KP10和KP22)对多黏菌素E耐药和多黏菌素B中度敏感，而红色圆框内的6株菌株(KP20、KP27、KP29、KP43、KP51、KP62)对多黏菌素E和多黏菌素B均敏感，KP09与KP43更是分离自同一医院的同一个科室，多黏菌素作为目前临床治疗革兰阴性菌感染的最后一道屏障，在多重耐药革兰阴性菌感染的治疗中耐药率低、治疗效果好，特别是对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌效果显著[8]，而本研究这一发现，提示我市大型综合医院里已开始流行耐多黏菌素E的ESBLsKP，值得防控部门高度关注。而对MLST的最小生成树(MST)分析发现(图2)，不同耐药特征的KP有不同的菌落分布特性，hvPK以ST23和ST65为主要流行型，STs分布的比较集中，这与国内其他地区的报道一致[9]，值得注意的ST25与ST65、ST1135分别都只有1个管家基因差异，亲源关系非常密切，但耐药谱分析显示ST65与ST1135都是对抗生素全敏感的，ST25对7种抗生素耐药，而KP14(ST25)与产ESBLs的KP52(ST17)间也只有2个管家基因差异，亲源关系密切，而这8株菌株都分离自同一间医院，KP14与KP52更是分离自同一间ICU病房，这提示该医院可能存在优势的菌型，耐药基因元件不仅在同ST型菌株间存在传递的风险，并且在不同ST型菌株间也同样存在该风险；CRKP主要以ST11为主要流行型，ST型分布比较集中，主要在ST690周围，彼此间的亲缘关系比较近，与我国目前的主要流行型一致[10]，CRKP的耐药谱显示除了对碳青霉烯药物耐药外，至少还对14种药物耐药；ESBLs KP主要以ST37为主要流行型，分布同样也相对集中，主要围绕在KP05(ST35)周围，而耐药谱分布也显示不同ST型间耐药情况差别也不大，这提示该医院存在这个菌型的优势克隆群；其他类型MDRKP的ST型呈多态性分布。

图1 63株肺炎克雷伯菌菌株耐药谱表Fig. 1 Drug-resistant spectrum of 63 strains of Klebsiella pneumoniae

图2 63株肺炎克雷伯菌最小生成树(MST)Fig. 2 63 strains of Klebsiella pneumoniae MST

根据本文的研究结果，可见本地区医疗机构KP临床分离株的耐药谱与菌落分布情况都各具特征，高毒力但抗生素敏感型的hvPK与多重耐药的KP间呈现不同的菌落特征，同时不同菌落特征的菌株间存在耐药元件相互传递的情况，而耐多黏菌素E的ESBLsKP出现尤其值得防控部门的高度关注，因此应加强院内肺炎克雷伯菌监测，防止出现高毒力菌株获得多耐药基因元件后出现高毒力强耐药的肺炎克雷伯菌。

图3 4类肺炎克雷伯菌分子流行特性图Fig. 3 Molecular epidemic characteristics of 4 types of Klebsiella pneumoniae