HPLC法测定头孢氨苄原料及胶囊中的有关物质

钟莹 陈红英 王健松

(广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂，广州 510515)

头孢氨苄为β-内酰胺类抗生素，耐酸，口服吸收良好[1]。临床上用于敏感菌所致的急性扁桃体炎、咽颊炎、中耳炎、鼻窦炎、支气管炎、肺炎等呼吸道感染、尿路感染及皮肤软组织感染等，其在生产过程中可能存在α-苯甘氨酸(杂质A)、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(杂质B)和Δ-2-头孢氨苄(杂质F)等[2]杂质。2015年版中国药典中该品种原料和胶囊有关物质测定方法采用高效液相色谱法[3]，但发现使用该法头孢氨苄与其同分异构体Δ-2-头孢氨苄难达到有效分离，并且流动相中磷酸二氢钾溶液的浓度较高。本文对方法进行了研究和改进，可使各杂质峰得到有效分离和检出，更好保障产品质量。

1 仪器与试药

1200高效液相色谱仪(DAD检测器，Agilent公司)，1260高效液相色谱仪(DAD检测器，Agilent公司)，CPA225D十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)。

头孢氨苄(厂家A，批号：00167)，头孢氨苄胶囊(厂家B，规格0.125g，批号：2170501、2170601、2170602)，头孢氨苄对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130408-201410，89.0%)，杂质对照品：杂质A(α-苯甘氨酸，中国食品药品检定研究院，批号：130415-200904，98.5%)。杂质B(7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸，中国食品药品检定研究院，批号：130416-201006，94.4%)，杂质F(Δ-2-头孢氨苄，TRC，批号：6-RNP-168-2，95%)，甲醇(色谱纯，美国Merk公司)，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

2.1.1 色谱条件

色谱柱Thermo Hypersil GOLD，C18(4.6mm×100mm, 3μm)；流动相：流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用氢氧化钠试液调节pH值至5.0)，流动相B为甲醇，梯度洗脱(0～20min，A：95%→55%；20～37min，A：55%→95%；37～40min，A保持95%)；检测波长220nm；流速为1mL/min；进样量20μL。

2.1.2 系统适用性

取头孢氨苄，杂质A、B和F对照品适量加pH7.0磷酸盐缓冲液适量超声使溶解，加流动相A稀释制成各含10μg/mL的混合溶液，作为系统适用性溶液。记录色谱图，见图1，头孢氨苄峰理论塔板数为55968，杂质A与杂质B的分离度为1.8，头孢氨苄与杂质F的分离度为10.4。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

取杂质A、杂质B和杂质F对照品各约10mg，精密称定，置于同一100mL量瓶中，加pH7.0磷酸盐缓冲液约20mL超声使溶解，再用流动相A稀释至刻度，摇匀，精密量取2mL，置于20mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品溶液。

图1 系统适用性HPLC色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of system suitability

2.2.2 供试品溶液

分别取样品适量，精密称定，用流动相A溶解并稀释制成含头孢氨苄1.0mg/mL的溶液，作为供试品溶液。

2.2.3 自身对照溶液

精密量取供试品溶液1mL，置于100mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

2.3 测定法

精密量取供试品溶液、对照溶液与杂质对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，杂质A、B和F按外标法以峰面积计算；其他单个杂质按自身对照法计算(图2)。

图2 供试品溶液的HPLC色谱图Fig. 2 HPLC chromatogram of sample

2.4 与中国药典2015年版方法比较

2.4.1 色谱条件

采用欧洲药典和中国药典方法，结果头孢氨苄和杂质F分离度分别为0.87和1.15，均未达到基本分离(图3)。为提高头孢氨苄和杂质F的分离度，流动相组成选择浓度低的盐溶剂(0.05mol/L pH5.0磷酸二氢钠溶液-甲醇)，选用粒径小的色谱柱，并优化了流动相梯度洗脱条件。结果各峰分离效果好，分析时间合适(图1)。

2.4.2 系统适用性试验

中国药典系统适用性要求为：供试品溶液80℃破坏60min后，头孢氨苄与相邻峰分离度应大于1.5。但破坏程度超过20%，产生的杂质峰较多，采用中国药典2015年版色谱条件，头孢氨苄与前后相邻杂质峰的分离度为3.04和1.66，但其他降解杂质峰之间分离度较差(图4)。采用优化后方法，头孢氨苄与前后相邻杂质峰的分离度为2.55和2.09，其他降解杂质峰之间分离度良好，说明方法可使降解杂质峰得到有效分离和检出(图5)。因破坏条件过于剧烈，系统适用性试验改为考察杂质A和B，头孢氨苄和杂质F的分离度更为合理，具体见“2.1.2”项。

2.4.3 样品测定

分别采用本实验方法和中国药典2015年版方法，对原料、胶囊以及在25℃/75%相对湿度(RH)条件下放置10d的原料进行对比检测，结果见表1～2。结果本实验方法能有效检出杂质F，且检出的杂质个数更多，见图6～7，有助于发现产品中的质量问题，促使产品质量的提高。

图3 杂质F和头孢氨苄HPLC色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms of impurity F and cephalexin

图4 供试品溶液80℃破坏60min HPLC色谱图Fig. 4 HPLC chromatogram of sample placed under 80℃ for 60min

图5 供试品溶液80℃破坏60min HPLC色谱图—优化后方法Fig. 5 HPLC chromatogram of sample placed under 80℃ for 60min—optimized method

3 方法学验证

3.1 专属性

3.1.1 空白干扰试验

称取空白辅料(相当于0.125g规格一粒的量)置100mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取20μL注入液相色谱仪，结果空白辅料无干扰。

3.1.2 强制破坏性试验(表3)

取原料及胶囊分别用1mol/L盐酸溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、3%过氧化氢和高温60℃、光照等苛刻条件进行破坏试验后，按上述色谱条件进行检测。

结果表明空白溶剂对测定无干扰，在各种破坏条件下所得的降解产物峰与主成分峰分离良好，降解产物峰之间也具有良好的分离度，各条件下主峰纯度因子均大于990。通过比较试验前后总峰面积的变化，物料平衡(A破坏后总峰面积/A破坏前总峰面积×100%)在90%～110%，方法具有专属性。杂质A和杂质B在各条件下均较稳定，杂质F在碱性条件下稍增加。

3.2 其他验证项目

对本实验方法的定量限、检测限、准确度、重复性和溶液稳定性等进行了研究，见表4，结果方法的灵敏度、精密度和准确度等都较好，方法科学、合理、可行，适用于头孢氨苄原料及胶囊有关物质检测。

4 讨论

中国药典2015年版头孢氨苄原料及胶囊有关物质测定方法中流动相组成为0.2mol/L磷酸二氢钠溶液(pH5.0)-甲醇，在此条件下头孢氨苄与杂质F分离度为1.15，未能达到基本分离，且流动相中磷酸二氢钠的浓度较高，易析出晶体，阻塞色谱柱，系统适用性试验对供试品溶液破坏程度过于剧烈。本法参考欧洲药典9.4[2]头孢氨苄原料有关物质测定方法，降低磷酸二氢钠溶液的浓度，筛选了合适的色谱柱，并优化了梯度洗脱条件，不但主峰及杂质峰出峰时间适宜，并能有效地分离各个杂质峰。经破坏后的降解产物在此色谱条件下也能有效地与主峰完全分离，具良好的专属性。

杂质A和杂质B稳定，在强制降解试验和稳定性中均未见增长。杂质F为头孢氨苄的同分异构体，在碱性条件下稍增加，在稳定性放置过程中会增加。方法中以杂质对照品外标法检测这3个特定杂质的量，能较好地分析各杂质在稳定性放置过程中的变化趋势，有助于发现产品中的质量问题，促使产品质量的提高。

采用本方法分别对头孢氨苄原料及胶囊进行有关物质检测，方法的适用性良好，并将结果与中国药典2015年版测定结果比较，具有更强的分析杂质的能力。本方法简单、灵敏，适用于头孢氨苄原料及胶囊有关物质的检测。

表1 头孢氨苄及胶囊有关物质测定结果—2015年版中国药典方法Tab. 1 The determination results of the related substances of samples—ChP 2015

图6 25℃/75%RH放置10d样品HPLC色谱图Fig. 6 HPLC chromatogram of sample placed under 25℃/75%RH for 10d

表2 头孢氨苄及胶囊有关物质测定结果—优化后方法Tab. 2 The determination results of the related substances of samples—optimized method

表3 强制破坏性试验测定结果Tab. 3 The determination results of the destructive tests

表4 其他验证项目测定结果Tab. 4 The determination results of other verification items

图7 25℃/75%RH放置10d样品HPLC色谱图Fig. 7 HPLC chromatogram of sample placed under 25℃/75%RH for 10d