人脐带Wharton胶来源间充质干细胞复合藻酸钠水凝胶构建组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损

解光越 孙振 刘冠华 孙晓威 李世超 张志勇

(唐山市工人医院骨科，河北 唐山 063500)

因外伤、运动性损伤、老年退变等原因导致的关节软骨损伤是临床上常见的疾病。老年人群尤为常见。关节软骨再生修复能力极其有限，一旦损伤，很难自身修复，并可进一步发展成为骨性关节炎，累及整个关节功能〔1,2〕。因此，对早期的关节软骨损伤患者进行有效的干预治疗具有重要的临床意义。微骨折等传统的治疗方式均差强人意，主要以纤维软骨修复为主，修复组织力学强度差，远期预后差〔3〕。近些年来，软骨组织工程技术作为一种新兴的治疗手段成为研究的热门。种子细胞的选择是软骨组织工程重要因素之一。本研究以人脐带Wharton胶来源间充质干细胞(MSCs)作为种子细胞，复合藻酸钠水凝胶(Alg)构建组织工程软骨，用于修复兔膝关节全层骨软骨缺损。

1 材料和方法

1.1主要试剂与仪器 Ⅱ型胶原酶、藻酸钠盐、蕃红O染液、天狼星红染液、戊巴比妥钠、多聚甲醛(Sigma，美国)；胰蛋白酶 、DMEM细胞培养液、胎牛血清 (Gibco，美国)； 高分辨率电子计算机断层扫描(Micro-CT，GE，加拿大)。

1.2方法

1.2.1人脐带Wharton胶来源MSCs的分离培养 获取足月产健康产妇脐带组织(患者知情，并通过唐山市工人医院伦理委员会审核批准)，无菌条件下，磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，去除血污等杂物。剔除动、静脉及外膜组织，分离出Wharton胶。眼科剪剪碎至1 mm3大小颗粒，加入3倍体积浓度为0.075%的Ⅱ型胶原酶，37℃下磁力搅拌消化过夜。加胎牛血清(FBS)终止消化，离心10 min，去上清，PBS洗3遍，加入含有用含10%胎牛血清培养基吹打均匀后接种至培养瓶中，置于37℃,5% CO2培养箱中孵育。每2～3 d更换培养液。第3代(P3代)细胞用于兔膝关节全层软骨缺损修复。

1.2.2人脐带Wharton胶MSCs复合Alg修复兔膝关节股骨滑车骨软骨缺损 将含有4×105/ml人脐带Wharton胶MSCs的细胞悬液与等体积浓度为2.4%藻酸钠溶液充分混合。向混合液中添加102mmol/L CaCl2溶液使海藻酸钠溶液成水凝胶胶，获得细胞终浓度为2×105/ml的人脐带Wharton胶MSCs/Alg组织工程复合物。选取24只3月龄新西兰大白兔，雌雄不拘(由唐山市工人医院实验动物中心提供，并通过医院伦理委员会审核)。按软骨缺损修复方式的不同，随机均分为三组：Alg+MSCs组；Alg组；单纯缺损组。术前禁食12 h，戊巴比妥钠诱导麻醉成功后，双膝关节取外侧纵切口，脱位髌骨，暴露股骨滑车，使用直径2 mm的无菌环钻造直径2 mm，深1.5 mm圆柱形全层骨软骨缺损。Alg+MSCs组软骨缺损以人脐带Wharton胶MSCs/Alg组织工程复合物修复；Alg组软骨填充以单纯Alg；单纯缺损组的软骨缺损旷置作为对照。术后3个月、6个月处死实验动物取材。

1.3检测指标

1.3.1Micro-CT 扫描 术后6个月处死实验兔子，获取膝关节，4%多聚甲醛固定24 h后置Micro-CT下扫描。三维重建软骨修复兴趣区后进行一下软骨下骨形态学参数分析：骨体积分数(BV/TV)、骨矿物质密度(BMD)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)等。

1.3.2大体观察及国际软骨性复协会(ICRS)评分 获取术后3个月、6个月标本，分别由3个技术熟练的人员仔细观察修复组织的大体表现，并记录修复组织的色泽、与周围正常软骨整合等情况。并按照ICRS提出的评分标准进行大体观评分。

1.3.3病理学染色及组织学评分 术后3个月、6个月处死实验动物，获得膝关节，多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片。分别进行蕃红O染色观察修复组织软骨细胞外基质沉着，天狼猩红染色观察修复组织的胶原成分以及胶原排列。根据Wakitani 组织学评分准则进行组织学评分。

1.3.4力学检测 获取术后6个月膝关节样品，对修复软骨进行力学检测，分别分析硬度、折合模量、接触刚度等参数，以正常软骨为对照。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析及SNK检验。

2 结 果

2.1Micro-CT扫描 术后6个月，各组软骨下骨均得到一定程度的重建。BV/TV、BMD、Tb.Th、Tb.N等骨形态学参数分析结果显示，Alg+MSCs组均显著高于Alg组和单纯缺损组(P<0.05)，见表1，表明Alg+MSCs相较其他两组获得更佳的软骨下骨重建。

2.2大体观察及评分 大体观察显示术后3个月，Alg+MSCs组的修复组织表面光滑，色泽红润，与周围正常软骨的界限模糊。Alg组和单纯缺损组的修复组织表面欠光滑，色泽暗淡，与周围正常组织的界面明显。术后6个月，Alg+MSCs组修复组织色泽与正常软骨相近，与周围正常组织整合良好。Alg组和单纯缺损组的修复组织粗糙，与正常软骨存在明显的界限。ICRS大体观评分显示，各个时间点Alg+MSCs组均显著高于其他两组(P<0.05)，见表1。

表1 术后各组软骨下骨Micro-CT扫描参数、ICRS大体评分组织评分比较

与同时间点Alg组比较：1)P<0.05，与同时间点单纯缺损组比较：2)P<0.05，下表同

2.3病理学染色及组织学评分 蕃红O染色结果显示：术后3个月，Alg+MSCs组修复组织以透明软骨为主，着色与正常软骨组织接近，其内可见排列较规则的透明软骨细胞，软骨陷窝明显，新生软骨与周围正常组织整合较好。Alg组和单纯缺损组的修复组织以纤维样组织为主，着色浅淡，其内可见大量成纤维样细胞，与周围组织整合差。术后6个月Alg+MSCs组修复组织着色与正常软骨非常接近，修复组织内可见大量软骨细胞及陷窝，细胞排列方式更趋向正常软骨组织。Alg组和单纯缺损组的修复组织仍以纤维样组织为主，与周围正常软骨组织存在明显的界限(见图1)。

N表示正常软骨，R表示修复组织，箭头示修复组织与正常软骨的交界区图1 术后6个月修复组织蕃红O染色

天狼猩红染色结果显示：术后3个月，Alg+MSCs组修复组织内富含Ⅱ型胶原，胶原排列方向较规则。Alg组和单纯缺损组的修复组织内胶原类型主要为Ⅰ型和Ⅲ型，仅见少量Ⅰ型胶原。术后6个月，Alg+MSCs组修复组织内可见大量Ⅱ型胶原，胶原排列方向与周围正常软骨组织相近。Alg组和单纯缺损组的修复组织内仍以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，胶原排列杂乱无章(见图2)。组织学评分结果显示Alg+MSCs组各个时间点均显著高于Alg组和单纯缺损组(见表1)。

2.4力学检测 术后6个月，对修复组织的力学性能进行检测，结果显示Alg+MSCs组修复组织的硬度和折合模量均显著高于其他两组(P<0.05)，与正常软骨组织相似(P>0.05)。Alg+MSCs组修复组织的接触刚度小于正常软骨组织(P<0.05)，但显著高于Alg组和单纯缺损组(P<0.05)(见表2)。

N表示正常软骨，R表示修复组织，箭头示修复组织与正常软骨的交界区图2 术后6个月修复组织天狼猩红染色

3 讨 论

我国已经进入老龄化社会，现65岁以上的老年人口占总人口的8.5%，且平均老龄人口每年以3%的速度在持续增长。接近1亿人以上的老年人患有骨性关节炎。骨性关节炎引起疼痛、关节挛缩、活动障碍已经严重影响老年人的日常生活。骨性关节炎表现为关节腔局部的炎症合并有不同程度的软骨损伤，而常见骨性关节炎的治疗策略往往单纯解决炎症问题，软骨损伤依然存在。所以，解决老年人关节疼痛，同时控制炎症及改善软骨损伤尤为重要。

关节软骨覆盖于关节表面，具有传递分布负荷，减少骨端摩擦等作用。因其缺乏血管、神经支配，再生修复能力极其有限，一旦损伤，难以继续自身修复，这已达到国内外学者的共识〔1，2〕。随着关节软骨损伤病情的进展，可累及软骨下骨，发展成为骨性关节炎，影响整个关节，导致不同程度的关节功能丧失。关节炎晚期，关节置换成为无奈之举。这不仅严重影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，对关节软骨损伤患者提供有效的干预治疗措施具有十分重要的临床意义。药物对症治疗、微骨折技术等传统的治疗方法均未取得令人满意的效果。组织工程作为一种新兴的技术为组织再生修复提供了全新的思路和策略〔4〕。

种子细胞、支架材料、细胞因子是组织工程的三大重要因素。软骨组织工程的基本构思为选择合适的种子细胞在体外扩增至足够数量后与生物支架复合，构建具有功能的组织工程化软骨组织，再移植至软骨缺损处，以期修复软骨组织损伤。软骨细胞是常用的种子细胞之一，临床上自体软骨细胞移植(ACI)技术通过在患者膝关节非负重区取一小块软骨，体外进行培养扩增后再移植至软骨缺损处〔5〕。这种“拆东墙补西墙”的有创取材方式可能造成供区病变，而且软骨细胞在平面培养的过程中容易去分化，从而不同程度失去分泌软骨细胞外基质的能力，势必影响构建组织工程软骨的质量以及后续的软骨修复〔6〕。干细胞具有自我更新，多向分化等潜能，被作为重要的种子细胞来源。胚胎干细胞因面临伦理，移植后致瘤等问题，应用受到一定限制〔7〕。MSCs获取更容易，不受伦理限制，成为研究的热点。骨髓MSCs和脂肪肝MSCs是应用非常广泛的两种干细胞类型，但也存在诸多局限。如移植至体内后可能出现异位成骨，成脂等现象。另外随着年龄的增长，其自我更新和多向分化能力均明显下降〔8,9〕。因此，探索更佳的种子细胞是软骨组织工程面临的重要问题之一。 胎儿来源的MSCs被认为是非常有前途的种子细胞。脐带为胚胎外组织，获取较方便，而且不受伦理学的限制。Wharton胶为脐带血管周围的黏蛋白样组织〔10〕。人脐带MSCs(hWJMSCs)相比成人来源的MSCs具有更快的扩增速度和增殖能力，可成软骨方向分化，致瘤性低。另外脐带Wharton胶的细胞外基质成分与软骨细胞外基质成分相似，同时hWJMSCs表达蛋白多糖，Ⅱ型胶愿等软骨相关基因。而且hWJMSCs表达的相关生长因子、趋化因子及细胞因子的水平与软骨细胞相仿，因此hWJMSCs被认为软骨组织工程非常有前途的种子细胞类型〔11,12〕。本研究以hWJMSCs作为种子细胞复合藻酸钠水凝胶构建组织工程软骨可有效修复兔膝关节软骨缺损。这为软骨组织工程种子细胞的选择提供了新的思路，也为后续的临床转化医学研究提供了动物研究基础。