液相色谱-串联质谱法测定儿童化妆品中3种异噻唑啉酮类防腐剂

杨永超， 闫 婧， 赵好力宝， 李 晶， 于智睿， 李学洋

(天津海关(原天津出入境检验检疫局)工业产品安全技术中心，天津 300308)

异噻唑啉酮类化合物是一种广谱、高效、非氧化性杀菌防腐剂，其中常见的有2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)和1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)，已广泛用于工业循环冷却水、纺织品柔光剂和上光剂及造纸工业等各个领域[1 - 3]。研究表明，该类物质是一类致敏剂，可能引起过敏或皮炎等反应，过量接触还可导致皮肤灼伤，其中CMI 和MI 的致敏性和刺激性最强[4 - 7]。儿童是弱势群体，抵抗力较弱，更易受到侵害。目前，国内外对食品接触材料、玩具等日用品中异噻唑啉酮类杀菌剂的使用制定了严格的法规标准[8 - 11]。同时，异噻唑啉酮类化合物在欧盟化妆品法规中的限量要求也日益严苛[12 - 13]：至今，MI和CMI/MI(质量比3∶1)混合物的限量均降至0.0015%，后者仅准用于淋洗类产品，且同一产品中两者不可共用。我国现行的《化妆品安全技术规范》(2015年版) 规定MI的上限为0.01%，CMI/MI(3∶1)限量为0.0015%，且禁止用在留存型产品中，同时二者不可共用，这无疑为检测技术提出了更高的要求。

《化妆品安全技术规范》(2015年版)中异噻唑啉酮类化合物的检测为高效液相色谱(HPLC)法，该方法灵敏度较低，MI和CMI定量限为13 mg/kg(即0.0013%)非常接近现有限量要求，且易出现假阳性，已无法满足检测需求。此外，异噻唑啉酮类化合物的检测方法还有紫外分光光度法[14 - 15]、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)[16 - 17]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[18 - 19]等。LC-MS/MS法分析时间短、选择性好，灵敏度高，更加适合复杂体系中异噻唑啉酮类化合物的测定。然而，LC-MS/MS方法检测化妆品中异噻唑啉酮类物质的文献报道很少，并且只检测MI和CMI两种防腐剂，未涉及BIT。对于儿童化妆品中异噻唑啉酮类防腐剂的检测更是未见报道。在此基础上，本文建立了一种简单、快速、准确的同时测定儿童化妆品中3种异噻唑啉酮类防腐剂含量的LC-MS/MS方法，该方法能够满足现有化妆品指令对这类防腐剂的限量要求，同时可有效保护儿童消费者安全。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

LC-MS/MS系统(美国，Thermo Fisher公司)；S 30H型超声波清洗机(德国，Elma公司) 。

2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MI)(CAS：2682-20-4，纯度：98.2%)， 5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMI)(CAS：26172-55-4，纯度：99.0%)，1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)(CAS：2634-33-5，纯度：99.9%)，均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH。分别称取10 mg(精确至0.1 mg)MI、CMI和BIT标准品于50 mL容量瓶中，以0.4%乙酸溶液定容，配成3种质量浓度为200 mg/L的标准溶液；每种标准溶液移取1.0 mL(精确至0.1 mL)至10 mL容量瓶，纯水定容，得浓度为20 mg/L混合储备液。甲醇(色谱纯，美国Grace)；甲酸(色谱纯，美国Aladdin)；乙酸(色谱纯，天津赛孚瑞)；实验用水为超纯水。

1.2 样品制备

称取1.0 g(精确至0.0001 g)样品，置于15 mL带盖带刻度样品管中，加入10 mL超纯水，混匀，超声提取20 min，取上层清液经0.22 μm滤膜过滤后，待测。

1.3 LC-MS/MS条件

液相色谱条件：Waters Symmetry®C18色谱柱(150×2.1 mm，3.5 μm)；流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(45∶55,V/V)，等度洗脱，流速200 μL/min；柱温：室温；进样体积：5.0 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；毛细管电压：4 000 V；鞘气压力：241 kPa；辅助气压力：69 kPa；毛细管温度：350 ℃；监测模式：选择反应监测(SRM)模式；采集时间：8 min。质谱采集参数如表1所示。

表1 MI、CMI和BIT的MS/MS采集参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

MI、CMI和BIT 均是含氮杂环化合物，易结合H+形成正离子，因此分析过程选择电喷雾电离正离子模式(ESI+)。首先，对待测物进行一级质谱分析，优化喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子源温度等参数，获得待测化合物稳定的准分子离子峰。之后，对待测物的分子离子进行二级质谱碎片分析，选取强度较大的3个子离子，并优化碰撞能量、丰度最高的特征子离子作为定量离子，其它两个作为定性离子(表1)。

2.2 色谱柱的选择

本方法对Waters XTERRA®MS C18色谱柱(100×2.1 mm,3.5 μm)和Waters Symmetry®C18色谱柱(150×2.1 mm,3.5 μm)进行了考察。同一标准溶液，在相同流动相的条件下，二者的峰形都比较好，两根柱子的第一个峰的响应值几乎无差别，但是Waters Symmetry®C18柱第二个峰和第三个峰的响应值明显更高。因此，选择Waters Symmetry®C18色谱柱。

2.3 流动相的选择

3种防腐剂均是含氮杂环化合物，易结合H+，因此流动相的水相采用含0.1%的甲酸。考察乙腈-0.1%甲酸溶液(体积比为30∶70)和甲醇-0.1%甲酸溶液(体积比为40∶60)两种流动相，分别进行等度洗脱。结果表明：(1)采用前者时，CMI的峰后延且CMI和BIT峰分离度不高；(2)采用后者时，峰形和分离度较好。因此，采用甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相。为进一步缩短测试时间，方法加大了甲醇的比例，最终选择甲醇-0.1%甲酸溶液(45∶55,V/V)作为流动相，等度洗脱，洗脱可在5 min内完成。

2.4 提取溶剂的选择

MI、CMI和BIT都是极性化合物，易溶于水、甲醇。本方法考察了水和甲醇对3种防腐剂的提取情况(图1)。从图中可看到，甲醇的提取效率略高，但是考虑到：一方面水无毒；另一方面儿童接触化妆品主要是嘴和皮肤两种途径，水更接近儿童的唾液和汗液，并且文献和相关标准[19-20]采用的提取溶剂为水。因此，方法选用水作为提取溶剂。

2.5 提取时间优化

方法以水为提取溶剂，分别测试了3、5、10、15、20 min时的提取效率，见图2。爽肤水和面霜样品中MI和CMI相对比较容易提取，基本10 min之内提取完全，而眼影中BIT则至少需要15 min完全提取。为确保样品中防腐剂全部提取，本方法提取时间最终定为20 min。

2.6 线性范围

精密吸取混合标准储备液，以去离子水稀释，得到3种防腐剂质量浓度均为5、10、20、50、100、200、500 、1 000、2 000 μg/L的系列混合标准溶液(共计9个浓度点，若样品浓度超出范围，可按比例适当稀释)。按1.3仪器条件上机测试，记录3种异噻唑啉酮化合物的峰面积，每个浓度点测试3次，取平均值。以浓度(x,μg/L) 为横坐标，主峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归。得到的回归曲线如表2所示。结果显示，3种防腐剂在5～2 000 μg/L范围内线性良好。

表2 MI、CMI和BIT的线性回归方程及相关系数

2.7 检测限、定量限和检出浓度、最低定量浓度

采用逐级稀释标准溶液方法进样，以信噪比(S/N)为3的样品浓度为检测限浓度；以S/N为10的样品浓度为定量限浓度。本方法对3种防腐剂MI、CMI和BIT的检测限和定量限分别为2.0、2.0、1.0 μg/L和5.0、5.0、2.0 μg/L；当取样量为1.0 g，定容体积为10 mL时对应的最低检出浓度、最低定量浓度分别为0.020、0.020、0.010 μg/g和0.050、0.050、0.020 μg/g。

2.8 回收率和精密度(RSD)试验

取空白面霜类化妆品，分别添加0.075、0.150、0.750 μg混合标准品，每个浓度点平行6份，然后按照1.2节方法制备样品，1.3节仪器条件上机测试。记录峰面积，根据线性方程分别计算样品中MI、CMI和BIT的含量，得出相应回收率，结果见表3。实验结果表明，3种防腐剂的添加回收率在94.0%～105.6%之间，相应测定结果的RSD均小于5%(n=6)。该方法准确度和精密度良好。

表3 3种异噻唑啉酮化合物的添加回收实验结果(n=6)

2.9 样品检测

取市售11种儿童化妆品，按前述方法制备样品，上机测试，测试化妆品中3种防腐剂的含量。结果如表4所示，11种样品中3种样品检出防腐剂，包括保湿霜(Nourishing cream)、眼影(Eye shadow)和润肤霜(Moisturizing lotion)。3个阳性样品中，只有眼影(Eye shadow)未超限量要求，其他两种则明显超标，证明儿童化妆品市场存在风险。

表4 11种实际样品检测结果

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3 讨论

针对目前国内外化妆品最新法律法规的限量要求，结合我国儿童化妆品乃至整个化妆品行业特点，本文建立了测定儿童化妆品中3种异噻唑啉酮类防腐剂的LC-MS/MS方法。该方法线性范围广，精密度良好，灵敏度高，可满足最新的化妆品指令要求。将该方法应用于11种市售儿童化妆品中3种防腐剂的检验，检出3个阳性样品，其中2个严重超出限量值，表明风险是存在的，儿童化妆品市场监管有待加强。