改良QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时检测蔬菜中14种喹诺酮类抗生素残留

刘 畅

(哈尔滨市农产品质量安全检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150000)

喹诺酮类又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类合成抗菌药，主要作用于革兰阴性菌[1]。由于其具有价格低廉、高效低毒、抗菌广谱等优点，被广泛应用于防治动物疫病、提高养殖效益、保障公共卫生安全等方面。但是近年来，兽药抗生素的滥用以及国内一些蔬菜产区的抗生素超标情况多有报道[2 - 4]。蔬菜生长环境中的土壤、灌溉水、地下水、作为农田有机肥的动物粪便中均存在抗生素检出甚至是超标的情况[5 - 7]。段晓洁[8]的研究表明，生长环境中的抗生素会在植物体内迁移；叶菜对喹诺酮类抗生素的富集程度要比根茎类高；受污染的小白菜不同部位的喹诺酮类抗生素含量差异明显，依次为叶>根>茎。

目前，在受污染环境中收获的蔬菜的安全情况得不到根本保证，所以建立一种检测蔬菜中抗生素多残留的方法尤为重要。吴小莲等[9]使用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测蔬菜中4种喹诺酮类抗生素的残留，但该方法操作复杂，成本高，需要操作人员接触过多有机试剂，不适合大批量样品的同时检测。QuEChERS方法具有回收率高、操作简单等众多优点，并在动物源性食品中的抗生素残留检测中也有较多应用[10 - 11]。传统QuEChERS方法使用MgSO4和NaAc作为萃取盐，使用乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)作为净化试剂，考虑到喹诺酮药物结构中的官能团会与这些萃取盐发生反应，以及在净化过程中除去多余水分，保证PSA净化效果达到最佳这两个因素，本文将QuEChERS前处理方法加以改良，选择了新的萃取盐和净化试剂，适用于蔬菜中喹诺酮类抗生素多残留的提取，结合超高效液相色谱-串联质谱法检测，为蔬菜中喹诺酮类抗生素多残留的定量分析和安全风险评估提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY TQD超高效液相色谱-串联质谱仪(美国，Waters)；MS3涡旋振荡器(德国，IKA)；3K15高速冷冻离心机(美国，SIGMA)；MULTIVAP-30位氮吹仪(美国，Organomation)；梅特勒ME204分析天平(感量0.0001 g)；Milli-Q高纯水发生器(美国，Millipore)；梅特勒PL4002电子天平(感量0.01 g)。

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诺氟沙星(NOR)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、依诺沙星(ENO)、培氟沙星(PEF)、氧氟沙星(OFL)、氟罗沙星(FLX)、洛美沙星(LOM)、奥比沙星(ORB)、沙拉沙星(SAR)、双氟沙星(DIF)、司帕沙星(SPA)、恶喹酸(OA)、氟甲喹(FLU)、诺氟沙星-d5、恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8，纯度均≥99.0%(德国Dr Ehrenstofer)；HAc(分析纯，常州通诚化工有限公司)；乙腈(优级纯，山东紫翔化工有限公司)；无水Na2SO4(优级纯，沈阳宁轩化工有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific)；甲酸(色谱纯，美国Sigma-Aldrich)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(色谱纯，天津博纳艾杰尔)。

1.2.2液相色谱分析条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)，柱温：40 ℃。流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，流速：0.30 mL/min，进样体积：5.0 μL。梯度洗脱程序：0～2 min，10%～25%A；2～3 min，25%～45%A；3～4 min，45%～90%A；4～5.5 min，90%A；5.5～5.6 min，90%～10%A。

1.2 实验条件

1.2.1样品前处理准确称取黄瓜样品10.00 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入1%乙酸乙腈10 mL，再加入10 g无水Na2SO4，立即涡旋1 min，8 000 r/min离心5 min。提取上清液8 mL于装有150 mg PSA和1 g无水Na2SO4的净化管中，用力摇匀净化管30 s，8 000 r/min离心5 min。吸取经过净化的液体5 mL于40 ℃下氮气吹干。残渣用200 μL乙腈、800 μL水溶解，0.22 μm滤膜过滤，供液相色谱-质谱质测定。

1.2.3质谱分析条件多反应监测模式(MRM)；电喷雾离子源(ESI+)，离子源温度110 ℃；脱溶剂气流速750 L/h；脱溶剂气温度400 ℃；毛细管电压3.0 kV；锥孔气速50 L/h。14种喹诺酮类抗生素定性定量离子对及对应碰撞气能量见表1。

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表1 14种喹诺酮类抗生素定性定量离子对及对应碰撞气能量

*Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

实验比较了不同种类和用量的净化剂对待测物回收率的影响，以获得最优的净化条件。在农产品分析中，PSA经常被用于去除基质中的一些干扰物质，如碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类、色素等。为了避免多余水分影响PSA的净化效果，这一步还需增加除水剂以确保净化效果。对于色素干扰不严重的基质如黄瓜等，分别设计PSA+Na2SO4(50 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(250 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(150 mg+500 mg)；PSA+Na2SO4(150 mg+1.5 g) 5组试验来考察PSA和无水NaSO4的最佳用量。在添加浓度为30 μg/kg水平下，选取PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)为净化剂的一组，喹诺酮的回收率在73.8%～114.3%范围内且重复性好；其他组喹诺酮的回收率数值相差较大，甚至依诺沙星、司帕沙星没有回收，所以选择PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)为净化剂。对于色素干扰严重的基质，可添加适量石墨化碳黑(GCB)排除色素干扰，但由于GCB对于平面结构的药物吸附作用极强，为保证回收率添加量宜少不宜多。以白菜为例，GCB的添加量在60 mg时，14种兽药的回收率基本能够保持在较好范围内。

传统的QuEChERS方法使用MgSO4和NaAc作为萃取盐，使目标物进入有机相。在本实验中使用这两种萃取盐后，14种喹诺酮中有8种没有回收，其余几种回收率也仅在40%左右。这可能是由于喹诺酮分子结构中的3-羧基和4-羰基可与Mg2+等金属离子螯合[13]，进而造成了目标物回收率低。改用中性的不与目标物发生反应且吸水量更大的无水Na2SO4作为萃取盐，得到了较好的回收率。对于黄瓜这种含水量较高的蔬菜无水Na2SO4的用量要达到10 g才能充分吸收水分，为后续使用PSA净化创造良好条件；而对于含水量不如黄瓜的茄子等基质来说，为减少过多杂质干扰，无水Na2SO4的用量以6～8 g为宜。

1.2.2 排除标准 排除入组时根据病史采集情况，已经患有冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑出血，脑梗死，脑栓塞的人群。

基质效应(ME)可以用提取后加标法定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应强度的比值来评价，即ME=B/A。其中A表示目标物在空白基质溶液中的响应值，B表示目标物在纯溶剂溶液中的响应值。如果ME>1，说明产生基质增强效应；ME<1，说明产生基质抑制效应；ME=1，说明不存在基质效应[14]。以黄瓜为基质，使用净化试剂前后的基质效应变化情况见图2。结果表明，14种喹诺酮类抗生素中只有3种呈现基质抑制效应，其余均表现为基质增强效应。在使用净化剂后，大多数目标物的基质效应得到抑制。

2.2 净化试剂的选择

烟台市通过大力实施生态建设工程，不断加大环境保护力度，加强重点流域湿地建设，推动森林和湿地资源实现稳步增长。今年以来，烟台市完成造林11.68万亩，森林抚育20万亩，湿地保护与修复7.6万亩，生态环境持续改善。

图1 不同浓度乙酸乙腈提取效果的比较Fig.1 The comparison of three different concentrations of acetic acid-acetonitriles in extraction efficiencies

图2 净化过程对14种抗生素基质效应的影响Fig.2 The influence purification process on the matrix effect of 14 antibiotics

喹诺酮是两性化合物，在酸性环境下更容易提取。根据文献报道[12]，本实验选择0.1%、1.0%、4.0% 3个浓度的乙酸乙腈作为提取液来考察目标物的提取效果。在添加浓度为30 μg/kg水平下，不同浓度的提取液对14种喹诺酮类化合物的提取情况见图1。由图1可知，使用0.1%乙酸乙腈作为提取液时，目标物提取率过低，数据波动范围大，精确度差；使用1.0%乙酸乙腈作为提取液时，各目标物的提取率在较好的范围内，平行数据波动不明显、精确度良好；随着乙酸浓度增加，有个别化合物的提取率达到120%以上，呈现出明显的基质增强效应，且精确度最差。因此，选用1.0%乙酸乙腈作为提取液。

2.3 方法学评价

使用空白样品的提取液，分别配制浓度为0,1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列标准溶液，氟罗沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星以诺氟沙星-d5为内标；洛美沙星、奥比沙星、双氟沙星、环丙沙星以环丙沙星-d8为内标；恩诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、恶喹酸、氟甲喹以恩诺沙星-d5为内标，绘制标准曲线，14种目标物在1.0～100.0 μg/L范围内线性关系良好，其线性方程和相关系数列于表2。用信号强度和噪声的比值(S/N=3)计算检出限(LOD)，以S/N=10时对应的含量为定量限(LOQ)(表2)。以黄瓜为基质，考察方法的准确度，在3个添加浓度下，14种喹诺酮类抗生素的回收率和相对标准偏差(RSD)具体数据见表2。

将本方法与已被报道的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法[9]和分散液液微萃取-高效液相色谱法[15]进行对比，具体情况见表3。

表2 黄瓜中14种喹诺酮类抗生素的线性方程、相关系数、检出限和定量限及不同添加浓度下的回收率、精密度

表3 本方法与其他文献方法的比较

从表3中可以看出，本方法能够同时检测的喹诺酮类参数更多；前处理过程考虑的影响因素更少。在能够满足检测需求，以及达到同等检测水平的情况下，本方法操作简单、稳定性好、准确度高且适用于大批量样品多参数的同时检测。

2.4 实际应用

以此方法检测了市场上不同种类蔬菜中喹诺酮类抗生素的残留情况。随机抽取白菜、黄瓜、茄子、甘蓝等4种蔬菜共12份样品，均未检出上述14种抗生素残留。可能的原因有：本方法只检测了蔬菜的可食用部分，其他部分是否有喹诺酮类抗生素残留的情况未知，按照段晓洁[8]的研究结果，抗生素是否迁移到蔬菜其他部位有待研究。

3 结论

本实验建立了可同时检测蔬菜中14种喹诺酮类药物多残留的超高效液相色谱-串联质谱法，并优化了QuEChERS方法前处理步骤。将这两种方法相结合，同时利用同位素内标法降低基质效应，使方法的准确度、精密度、灵敏度、重现性均能满足分析要求，节省了经济成本、人员成本和时间成本，能获得多种参数的同时检测。