饲粮添加鼠李糖乳酸杆菌GG对轮状病毒感染的断奶仔猪回肠黏膜屏障功能的影响

毛湘冰，汤 俊，陈代文，余 冰，何 军，郑 萍，虞 洁，罗钧秋，罗玉衡

（四川农业大学动物营养研究所/动物抗病营养教育部重点实验室，成都611130）

乳酸杆菌是人和动物肠道内的固有菌群之一，近些年的研究表明，乳酸杆菌具有明确的益生菌特性，即可维持胃肠道健康[1-4]。鼠李糖乳酸杆菌GG（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）最初由Glodin和Gorbach从健康人的粪便中分离得到，也表现出了诸多益生菌特性，如高黏附能力、高抗病原活性和胃酸抗性[5-7]。本团队前期的研究已表明，饲粮中添加LGG可改善RV攻毒对断奶仔猪生长性能和腹泻的影响，而这一过程与其可改善仔猪免疫功能和空肠屏障功能有关[8-9]。

轮状病毒（rotavirus，RV）是一种双链RNA病毒，也是一种诱导幼龄动物和婴幼儿严重胃肠道损伤和腹泻的主要病原；通过流行病学的研究表明，RV极易感染仔猪，于世界各地的猪场均有感染，且初生仔猪感染后的死亡率可达到100%，其在仔猪的易感部位集中于消化道前段（如空肠）[10-12]。但是，近年的研究表明，RV也会导致无菌猪回肠的损伤，且LGG的处理可以在一定程度上缓解RV对无菌猪回肠的影响[13]。目前，对于饲粮添加LGG是否可缓解RV感染影响正常仔猪回肠黏膜屏障功能尚未见报道。因此，本试验目的为考察饲粮中添加LGG对RV感染仔猪回肠屏障功能的影响，以期进一步完善LGG缓解RV感染对机体影响的可能因素，这也将为LGG作为益生菌在动物生产上的应用和推广提供试验支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

LGG菌粉：1010CFU/g，脱脂乳包被（中国农业大学农业部饲料工业中心提供）。

RV：OSU（G5P9）毒株（ATCC#VR-893），购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验动物与设计

试验采用2×2因子设计，选取24头平均体重约为6.69 kg健康的断奶仔猪（“杜×长×大”），两个因子分别为LGG处理（添加或不添加109CFU/kg LGG饲粮）和RV攻毒（灌服轮状病毒或无菌培养液）。全部仔猪采用代谢笼单笼饲养。试验第1 d空腹称重后，根据同质原则，将所有仔猪随机分为2个处理，每个处理12个重复，每个重复1头猪，分别饲喂基础饲粮或添加109CFU/kg LGG饲粮。试验第15 d，所有仔猪灌服100 mmol/L NaHCO3溶液5 mL，20 min后，每个饲粮处理中随机选取6头仔猪口服RV（1.4×107TCID50/mL）3 mL，剩余仔猪口服无菌培养液3 mL。此攻毒方法按本项目组前期研究发表的文献[8，14-16]进行。试验期为19 d。

1.3 试验饲粮及营养水平

试验采用玉米-豆粕型基础饲粮，参照NRC（2012）7～11 kg阶段仔猪营养需要配制。通过在基础饲粮中添加0或109CFU/kg LGG构成试验饲粮，添加的LGG等量替代基础饲粮中的玉米。基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.4 饲养管理

仔猪饲养试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地进行。所有仔猪预饲2 d，使其适应粉状饲粮和饲养环境。猪舍温度控制在27～30℃，相对湿度不高于80%，每天饲喂4次（08∶00、12∶00、16∶00和20∶00），以每次采食后料槽有少量余料为度。所有仔猪自由饮水，试验期间消毒、清扫按常规程序进行，并保持猪舍通风、清洁。

1.5 RV培养

RV的培养、强化和病毒滴度测定选用恒河猴肾细胞系（MA104）进行，具体操作方法按文献[14]。

1.6 测定指标及方法

1.6.1 腹泻率

攻毒后，每天进行粪便评分（0：正常；1：黏性粪便；2：半液体状粪便；3：液体状粪便）；当粪便评分≥2时，记为腹泻。记录的相关数据用于计算每个处理组每天的腹泻率。

1.6.2 样品采集

试验第20天，通过心脏注射戊巴比妥钠（50mg/kg体重）和颈静脉放血的方法屠宰所有仔猪，迅速取出回肠，并用冰生理盐水冲洗。取3 cm的回肠固定于4%多聚甲醛溶液中，并通过载玻片刮取回肠黏膜，存于-80℃。

表1 基础饲粮组成及营养水平Table 1 The composition and nutrition levels of basal diets %

1.6.3 回肠黏膜形态的检测

仔猪回肠黏膜形态（绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度）的测定参考Mao X.B.等[15]的方法进行。

1.6.4 回肠黏膜轮状病毒抗体和非结构蛋白4的检测

称取约1 g回肠黏膜组织，按重量体积比1∶9的比例加入预冷的生理盐水，置于冰上匀浆后，匀浆液于冷冻离心机中以5 000 r/min离心10 min，取上清液用于指标检测。

仔猪回肠黏膜中RV抗体（rotavirus-antibody，RVAb）和非结构蛋白4（non-structural protein 4，NSP4）的浓度，采用上海诺渊有限公司生产的ELISA试剂盒测定，操作按照试剂盒说明书进行。

1.6.5 回肠黏膜中紧密连接蛋白和黏液蛋白基因表达

仔猪回肠黏膜中ZO-1、occludin、mucin1和mucin2的表达，采用实时荧光定量PCR技术测定，具体方法参考Mao X.B.等[16]进行。

1.7 数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2007进行初步整理，除了腹泻率的数据外，其他数据采用SAS 8.0软件中两因子方差分析，模型主效应包括RV攻毒和饲粮添加LGG以及二者之间的互作，差异显著后进行Duncan氏多重比较，各指标以每个重复为单位统计，数据以“平均值±标准误”表示。以P＜0.05为差异显著判定标准。

2 结果与分析

2.1 断奶仔猪腹泻率和回肠黏膜RV-Ab、NSP4浓度

从图1和表2中可以看出，未攻毒的对照组和LGG组（即RV-CON和RV-LGG）未发生腹泻，且RV攻毒诱导了仔猪的腹泻发生，提高了回肠黏膜中RV-Ab和NSP4的含量（P＜0.05）；而饲粮中添加LGG可以延缓仔猪腹泻的发生，降低了腹泻率，并降低了回肠黏膜中NSP4的含量（P＜0.05），但对RVAb含量无显著影响。

2.2 断奶仔猪回肠黏膜形态学

从表3可以看出，RV攻毒显著降低了断奶仔猪回肠黏膜的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度（P＜0.05），增加了回肠黏膜的隐窝深度（P＜0.05）；饲粮添加LGG显著提高了回肠黏膜的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度（P＜0.05），有降低回肠黏膜隐窝深度的趋势（P=0.08），且显著缓解了RV攻毒对仔猪回肠黏膜的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度的影响（P＜0.05）。

图1 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪腹泻率的影响Figure 1 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on rate of diarrhea in the weaned pigs

表2 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪回肠黏膜RV-Ab与NSP4含量的影响Table 2 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the contents of RV-Ab and NSP4 in the ileal mucosa of weaned pigs

表3 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪回肠黏膜形态学的影响Table 3 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the ileal mucosa morphology in weaned pigs

2.3 回肠黏膜紧密连接和黏液蛋白基因表达

从表4可以看出，RV攻毒显著降低了断奶仔猪回肠黏膜中ZO-1、occludin、mucin1和mucin2的表达（P＜0.05）；饲粮中添加POS显著提高了回肠黏膜中ZO-1、occludin、mucin1和mucin2的表达（P＜0.05），且显著缓解了RV攻毒对仔猪回肠黏膜中这些基因表达的影响（P＜0.05）。

3 讨论

腹泻依然是目前我国仔猪养殖的重要影响因素，其在降低仔猪生长性能的同时，甚至会带来死亡，严重影响生产效益。RV是引起仔猪腹泻的主要病毒性病原之一，RV的感染会引起严重的胃肠炎和腹泻，这主要是由于RV可导致肠道屏障功能的损伤[14-17]。本项目成员所在实验室近些年一直致力于缓解RV影响的研究，进而通过不断摸索已成功的构建了RV模型建立的方法，即口服碳酸氢钠后对31～35日龄仔猪进行口服RV液（106～107TCID50）3～4 mL，且这一剂量的RV灌服可诱导仔猪发生腹泻、免疫紊乱和肠道屏障功能损伤，并开展了不同营养素缓解仔猪感染RV的探索。而本研究中RV灌注也造成了回肠黏膜屏障功能的损伤，提高了回肠黏膜中NSP4和RV-Ab含量，与之前研究中的RV攻毒结果一致，这些表明本试验已成功构建了RV对仔猪的感染模型。

表4 饲粮添加LGG和/或RV攻毒对断奶仔猪回肠黏膜紧密连接和黏液蛋白基因表达的影响Table 4 Effects of dietary LGG supplementation and/or RV challenge on the gene expression of tight junction and mucins in the ileal mucosa of weaned pigs

NSP4是RV产生的一种非结构蛋白。近年来的研究发现，RV在诱导腹泻的过程中此非结构蛋白发挥着至关重要的作用，NSP4已被作为RV感染的重要标识之一[18]。本研究中，饲粮中添加LGG显著降低了RV攻毒仔猪回肠黏膜中NSP4的含量，表明LGG能在一定程度上抑制RV对回肠的侵袭。已有的大量研究表明，肠道屏障功能在抵御各种病原侵袭中起至关重要的作用[19]，但本研究中，LGG未改善仔猪回肠黏膜特异性免疫屏障（如RV-Ab水平未受调节），因此，LGG限制RV侵袭回肠可能源于其改善了仔猪回肠的非特异性屏障机制。

肠道非特异性屏障机制由黏膜上皮完整性、上皮细胞间的紧密连接和黏膜胶质层组成[19]。就相关的研究显示，以形态结构测定黏膜表面积可作为黏膜上皮完整性的评价方法[20]；肠上皮细胞间紧密连接的状态可通过测定细胞间紧密连接蛋白表达量说明[21]；肠道黏膜上皮细胞和杯状细胞产生的黏液蛋白是黏膜胶质层的重要组成[22]。本研究的结果表明，饲粮添加LGG可缓解RV攻毒对回肠黏膜形态及黏膜上皮紧密连接蛋白和黏液蛋白表达的影响，进一步证明了LGG抑制RV侵袭回肠的过程依赖于其对非特异性屏障机制的改善作用。

对比本团队前期有关饲粮中添加LGG对RV攻毒仔猪空肠黏膜屏障功能的研究结果[8]，可以发现，LGG对回肠的保护作用并未达到其在空肠中的效果，那么，RV侵袭部位的强度可能是影响LGG产生保护效果程度的重要因素。另外，对比Wu S.P.等[13]研究LGG处理对RV攻毒无菌猪回肠黏膜屏障功能的研究结果，可以发现，LGG对RV感染的正常仔猪回肠黏膜屏障功能的改善作用优于其对RV感染无菌猪的效果。因此，除了肠道黏膜非特异性屏障机制外，微生物屏障在LGG的保护过程中可能也发挥了重要的作用。

4 结论

饲粮中添加LGG可以缓解RV攻毒引起的腹泻；而这一过程中，LGG处理的作用至少部分是依赖于其对RV攻毒仔猪回肠黏膜非特异性屏障和微生物菌群机制的改善作用。