金线莲辣椒红素/玉红素合成酶基因CCS的克隆及表达模式分析

刘柄良，杨 琳，，付凤玲，李晚忱，张君诚，于好强*

（1.四川农业大学玉米研究所/农业部西南玉米生物学与遗传育种重点实验室，成都611130；2.三明学院，福建 三明365000）

金线莲（Anoectochilus）属于兰科开唇兰属，是多年生草本植物，俗称金线兰、金钱草或金草等，主要分布在福建、台湾、广东等亚热带及热带地区。从亚洲热带地区至大洋洲大约分布有40余种，我国有20个种，2个变种[1]，其中福建金线莲（Anoectochilus roxburghii）和台湾金线莲（Anoectochilus formasanus）是我国最具药用价值的2个近缘种[2]，其主要药用功效是凉血祛风，除湿解毒。由于金线莲具有株型小巧，叶型优美，墨绿色叶面镶嵌的金色叶脉呈网状排列等优美外观，所以近年来被作为观赏植物加以开发利用。由于金线莲自然繁殖率极低，加上人工盲目采挖，已造成野生金线莲濒临灭绝，福建金线莲已于1990年纳入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》（CITES 2003）和《中国物种红色名录》（CSRL2004）[3]。金线莲不同品种存在明显表型差异，例如，福建金线莲叶脉呈金色[4]，台湾金线莲叶脉呈白色，也被叫作银线莲[5]。随着研究的深入，金线莲的药用价值和观赏价值日渐提升，成为一方经济的主要产业之一。

金线莲的药用和保健成分除了黄酮类和多糖类外，辣椒红素/玉红素也是其中之一。辣椒红素/玉红素是一种四萜类天然色素，属于类胡萝卜素，不仅影响金线莲的观赏价值，也具有较好的保健和生物药效[6]，比番茄红素更利于人体吸收利用[7]，是清除自由基的一种重要抗氧化物质。研究表明，辣椒红素/玉红素合酶（capsanthin/capsorubin synthase，CCS）在辣椒红素合成的最后阶段催化辣椒红素-5，6-环氧化物转化为辣椒红素/玉红素，是辣椒红素/玉红素合成的限速酶之一[8-9]。

J.Deruere等[10]在1994年首次从辣椒中克隆到CCS基因，并证明是其为单拷贝。随后，Z.Jekni等[11]在2012年从百合属的植物中也克隆到CCS基因，并证明其在改变植物颜色方面起着重要作用。S.H.Ha等[12]从辣椒中克隆到CCS基因启动子，发现其是一个组成型启动子。M.H.Kumagai等[13]将CCS基因转入烟草，发现转基因烟草叶片中的辣椒红素含量占类胡萝卜素总量的36%。而后，Lang Y.Q.等[14]将橙色辣椒与红色辣椒杂交，对分离群体的CCS扩增检测，发现CCS下游区域是保守的，橙色辣椒成熟期不能转红的原因是由于CCS基因上游区缺失造成的。S.Jeknic等[15]将百合的CCS基因转入番茄中，发现CCS基因的超表达可以使番茄果实颜色发生较大的改变。此外，CCS基因的表达显著受到不同光质和盐胁迫诱导[16-18]；这些结果均表明CCS在调控植物颜色方面起关键作用。

本研究通过克隆福建金线莲和台湾金线莲的CCS基因，并对其序列进行生物信息学分析，用荧光定量PCR技术研究其在金线莲不同组织，及盐胁迫、紫外和红光诱导下的相对表达水平。以明确福建金线莲和台湾金线莲CCS基因的序列特征和表达特性，为进一步研究CCS基因功能提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

福建金线莲和台湾金线莲，均购于叶之典金线莲生物科技有限公司。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

将金线莲组培苗移植在装有营养土的花盆里，放置在25℃（昼）/20℃（夜）、相对湿度60%～70%和光照200μmol/（m2·s）（14 h）/黑暗（10 h）的光照培养室培养，生长18 w后，取长势一致的幼苗取根、茎、叶，液氮速冻并于-70℃保存。将其余幼苗随机分为3组，第1组转移至带孔的塑料泡沫板上，用Hoagland营养液培养5 d后进行盐胁迫（100 mmol/L NaCl）处理；第2组进行紫外光照射处理（波长253.7 nm）；第3组进行红光照射处理（波长650 nm）。分别于处理前（0 h，空白对照）及处理后0.5、1、2、4、8、12和24 h，取叶片，液氮速冻-70℃保存，设置3个生物学重复，每个时间点设置3次技术重复。以Trizol法提取各样品总RNA，再用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（TakaRa，大连）反转录合成cDNA。

1.3 辣椒红素合成酶基因（CCS）开放阅读框的克隆

根据台湾金线莲的转录组测序数据，筛选获得CCS基因的编码序列，采用Premier 5.0软件设计CCS基因开放阅读框（open reading frame，ORF）的扩增引物，上游引物为:5′-ATGAGCTCCTCCACGATCCT-3′，下游引物为:5′-TCAGGCGTGCTGCTGGTAG-3′。以空白对照的cDNA作模板，用高保真酶Prime STAR HS DNA polymerase（TakaRa，大连）进行PCR扩增。扩增总体系25μL:cDNA 1μL，5×Buffer 5μL，dNTP mix 2μL，PrimeSTAR高保真酶0.3μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 15.7μL反应程序为:95℃预变性3 min；之后按95℃变性30 s，61.5℃退火30 s，72℃延伸1.5 min扩增38个循环。扩增结束后，以1.5%琼脂糖凝胶在120 V电压下，电泳30 min。通过凝胶成像检测目标条带，并利用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，并进行3′端加腺嘌呤反应，连接至pMD19-T载体。挑取阳性单克隆，菌液检测后的阳性克隆并送上海生物工程公司测序。

1.4 CCS基因的生物信息学分析

用EXPASY在线数据（http://web.expasy.org/protparam/）对CCS基因的理化性质进行分析，使用GOR IV（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）对CCS基因的二级结构进行预测[19]；通过SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对CCS基因编码蛋白进行三级结构预测；使用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/wolfpsort.html）对CCS基因编码蛋白进行亚细胞定位预测。下载已知植物的CCS氨基酸序列，利用Clustal W软件进行CCS氨基酸序列的多序列比对，通过MEGA7.0工具构建系统进化树[20]。

1.5 金线莲CCS基因表达分析

以Primer5.0设计CCS基因的定量PCR检测引物（表1），各样品cDNA作为模板，参考Zhang G.等[21]的研究，以持家基因Actin作内参。用SYBR Green法在Bio-Rad CFX96型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）检测CCS基因的表达量；反应总体系为10μL:cDNA 1μL，SYBR Green I染料(TakaRa，大连)5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，ddH2O 3.2μL；反应程序:95℃预变性10 s，然后按95℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，延伸结束收集荧光，46个循环；之后从50℃开始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每个温度保持5 s。最后用2-△△Ct法计算各样品中CCS基因的相对表达量，并进行显著性分析。

表1 荧光定量PCR设计和使用的引物Table 1 The primers of qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 CCS基因的ORF序列

以空白对照的cDNA为模板，用方法2.3中设计的ORF扩增引物扩增CCS的ORF。测序及分析结果表明，福建金线莲CCS基因的ORF全长1 461 bp，编码486个氨基酸；台湾金线莲CCS基因的ORF全长1 458 bp，编码485个氨基酸（图1），分别命名为ArCCS和AfCCS。氨基酸序列比对发现，ArCCS与AfCCS编码的氨基酸序列相似度高达97%，二者共有14个氨基酸位点不同，序列长度上仅相差一个氨基酸（图2）。

图1 CCS基因ORF扩增片段Figure 1 The ORF fragments of CCS gene

2.2 CCS蛋白序列特征

利用ExPASy在线数据库对CCS基因编码蛋白的理化性质进行分析。结果表明，ArCCS蛋白质分子式为C2381H3707N667O672S33，相对分子质量为53 kD，等电点pI7.57，不稳定系数为56.88（＞40），亲水系数为-0.061（＜0）。AfCCS蛋白的分子式为C2382H3713N671O670S32，相对分子质量为53 kD，等电点pI 8.34，不稳定系数为55.06（＞40），亲水系数为-0.080（＜0）。说明两种金线莲CCS蛋白理化性质相似，均为不稳定的亲水蛋白。二级结构预测结果表明，ArCCS蛋白的氨基酸序列中α-螺旋占37.86%，伸展链占15.43%，无规则卷曲占46.71%。AfCCS蛋白的氨基酸序列中α-螺旋占39.38%，伸展链占16.08%，无规则卷曲占44.54%。二者的三级结构模型也高度相似，且二者均定位于叶绿体。进化分析结果表明，ArCCS与AfCCS蛋白与百合属的CCS蛋白相似性最高且进化关系更近，与苹果、梨CCS蛋白的相似度及进化关系较远（图3），表明我们克隆到的基因序列的确是金线莲的CCS基因。

2.3 CCS基因表达特性

qRT-PCR结果表明，ArCCS基因的表达无组织特异性，在根、茎、叶中的表达无显著差异。然而，AfCCS基因的表达存在显著的组织差异性，其在根中表达最低，茎中表达最高，与叶中的表达相比，差异达到极显著水平（图4）。

图2 氨基酸序列比对结果Figure 2 The results of amino acid sequence alignment

图3 不同物种CCS蛋白的系统进化树Figure 3 The phylogenetic tree of the CCS proteins from different species

对处理后的样品进行qRT-PCR检测表明，ArCCS基因的表达在盐胁迫后表达量先升高，在1 h达到最高，随后被抑制表达，在24 h其表达量达到最低。AfCCS基因表达受盐胁迫诱导上调表达，处理后其相对表达量极显著高于对照，处理后12 h其表达量达到最高（图5）。但是，紫外处理后二者的表达模式与盐胁迫处理后的表达模式相反，ArCCS基因表达受到紫外的诱导极显著高表达，而AfCCS基因被紫外抑制下调表达（图6）。在650 nm红光处理0.5 h，ArCCS基因表达量达到峰值且极显著高于对照（图7），说明ArCCS基因比AfCCS基因对远红光的响应更迅速。

3 讨论与结论

福建金线莲和台湾金线莲的CCS基因序列相似度高达97%，二者长度上仅相差1个甘氨酸（图2），我们推测这正是2个蛋白具有相似理化性质和空间折叠模型的原因。但研究结果显示二者在不同组织器官的表达特性以及对环境胁迫的响应存在显著差异；AfCCS基因主要在茎中表达，在根中几乎不表达；ArCCS基因在根、茎、叶中的表达无显著差异，无组织特异性；ArCCS基因和AfCCS基因的表达均受到盐胁和不同光质的诱导或抑制，且差异达到显著或极显著水平；说明ArCCS与AfCCS基因表达受不同顺式作用元件调控，推测二者的启动子区域可能存在显著差异。已有研究表明，CCS基因在百合、辣椒、纽荷尔脐橙等物种中表达特性也存在显著的时空差异性或受环境因素的显著影响[11，18，22-23]。CCS基因编码辣椒素合成酶，催化合成辣椒红素且与植物颜色紧密相关，CCS基因表达量越高，则辣椒红素积累越多，植株颜色越红[11，22-23]。福建金线莲叶脉表现金色、茎杆淡绿，而台湾金线莲叶脉呈现银色、茎杆红色，推测ArCCS基因和AfCCS基因的组织差异表达可能是造成其表型颜色差异的因素之一；但是，福建金线莲和台湾金线莲的根部颜色无明显差异，主要是因为根部长期缺光，导致辣椒红素无法合成。田士林[18]对辣椒CCS基因的研究表明，CCS基因受光诱导调控，既可在红色辣椒中表达也可在浅黄色辣椒表达；但大棚栽培和套袋遮光均会降低CCS基因表达，进而减少辣椒红素积累，影响果实颜色[24]。

综上，本研究成功克隆到福建金线莲和台湾金线莲的CCS基因，发现二者序列及其编码蛋白具有高度的相似性，但二者的表达特性存在显著差异并受到环境因素的显著诱导，为一进步研究其功能提供借鉴。

图4 ArCCS基因与AfCCS基因在根、茎、叶中的表达Figure 4 The expression of the ArCCS and AfCCS gene in the root，stem and leaf

图5 ArCCS基因与AfCCS基因在盐胁迫下的表达Figure 5 The expression of the ArCCS and AfCCS gene under the salt stress

图6 ArCCS基因与AfCCS基因在紫外光诱导下的表达Figure 6 The expression of the ArCCS and AfCCS gene under the UV stress

图7 ArCCS基因与AfCCS基因在红光诱导下的表达Figure 7 The expression of the ArCCS and AfCCS gene under the red light stress