5种灵芝菌株的农艺性状、活性成分和功效分析

金 鑫，周思菊，李 强，李 萍，谭 伟，李小林，黄文丽*

（1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，成都610061；2.桂林市农业科学院，广西桂林541006；3.四川省农业科学院土壤肥料研究所，成都610066）

灵芝（Ganoderma lucidum）隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes），多孔菌目（Polyporales）、灵芝科（Ganodermataceae）[1]，是我国的名贵中药材。《神农本草经》和《本草纲目》认为灵芝具有益气强身、扶正固本、延年益寿等功效。现代药理学研究证实灵芝含有如灵芝多糖和三萜类化合物等活性成分，具有调节免疫、抗肿瘤、抗衰老、保肝护肝、治疗心脑血管疾病等作用[2-3]。我国是世界灵芝的主要生产国和出口国，灵芝品种筛选研究也是中国食用菌种业研究的重要内容[4]。我国市场上栽培灵芝品种较多，不同灵芝品种的农艺性状和转化率及其活性成分含量和药效品质均有差异[5]。因此，本研究以5个不同来源的灵芝菌株为研究对象，对灵芝外观性状、色泽等农艺性状及转化率、多糖、三萜等活性成分和抗氧化作用和促进脾细胞增殖能力等进行了测试分析，为灵芝产品的开发和灵芝种业研究提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

金地灵芝（简称JD，登录号：MF476197）和黄灵芝（简称HLZ，登录号：MF476199）来自四川省农业科学院，平芝（简称PZ，登录号：MF476201）和圆芝8号（简称YZ8，登录号：MF476198）来自驻马店农业科学研究所，灵白（简称LB，登录号：MF476200）来自泰安市农业科学研究院。

1.1.2 栽培管理

试验在四川省德阳市食用菌专家大院进行，栽培时间为2015年1—6月。首先选取直径10～15 cm青冈树，截成15 cm长的小段木通过装袋、灭菌、接种，将接种完的菌袋全部搬入培养室内，温度控制在25～28℃，湿度控制在60%～70%。4月上旬将发菌培养好的菌棒进行脱袋覆土栽培，原基生长阶段控制湿度在85%～95%，温度控制在25～30℃，菌柄生长阶段和菌盖生长阶段控制湿度90%～95%，温度控制在28～30℃，子实体成熟期降低湿度到80%～85%，温度控制在25～30℃，子实体白色边缘消失并开始喷射孢子粉时表明进入成熟期，此时即采收同时进行数据测量。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集、农艺性状测定

采收后的子实体分别用游标卡尺测定灵芝子实体菌盖直径、菌盖厚度和菌柄长度，并计算转化率：转化率=（干产量/鲜段木重）×100%，分别随机选取30朵子实体作为试验样品，将样品子实体完全烘干至恒重，粉碎过筛孔尺寸为0.18 mm的筛备用。

1.2.2 多糖提取测定

称取30 g灵芝样品，以蒸馏水为提取溶剂，料液体积比1∶60，100℃浸提1 h，浸提2次，合并滤液，绘制标准曲线，再通过苯酚硫酸法测定多糖含量[6]。

1.2.3 三萜提取测定

称取20 g灵芝样品，按1∶20的料液体积比加入95%的乙醇，搅拌混匀后，300 W（30%）超声1 h，超声完成后浸泡8 h，抽滤获得灵芝三萜提取液。以熊果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸法测定三萜含量[7]。精确移取样品0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入新制的香草醛-冰醋酸溶液0.6 mL，再加入1.2 mL的浓硫酸摇匀，于70℃恒温水浴上保温反应30 min，流水冷却至室温，再加入冰醋酸定量到10 mL，摇匀。同时做空白对照，在552 nm处测定体系的吸光度。

1.2.4 不同品种灵芝的抗氧化活性测定

不同品种的灵芝经粉碎后，按照1.2.2获得多糖提取物，提取物经旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后备用。进行清除DPPH自由基能力测定[8]，超氧自由基（O2-）清除率测定[9]，羟自由基（·OH）清除率的测定[10]。

1.3 不同品种灵芝对脾细胞的增殖作用

1.3.1 脾细胞悬液制备

对SPF级6 W龄（18～22 g）的BALB/C小鼠进行无菌取脾，置于盛有适量（3～5 mL）无菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经筛孔尺寸为0.075 mm的筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心10 min（1 000 r/min）。然后将细胞悬浮于2 mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，调整细胞浓度为3×106个/mL。

1.3.2 淋巴细胞增殖反应

将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，每孔加75 mL ConA液（相当于7.5μg/mL），加入不同浓度的灵芝多糖提取物（0.05、0.1、0.5、1 mg/mL）100μL，以缓冲液替代灵芝提取物作为阴性对照，未加细胞的孔作为空白对照。置5%CO2，37℃CO2孵箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5 mg/mL）50μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，超声震荡（2 s）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570 nm波长测定OD值。

表1 不同灵芝菌株子实体农艺性状及转化率比较Table 1 Comparison of agronomic characters and conversion rateof different Ganodermalucidum strains

1.4 数据处理

试验测定的数据结果全部用±s表示，用SPSS17.0软件对结果进行t检验统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同灵芝菌株子实体农艺性状及转化率分析

从表1可以看出，5个灵芝菌株其子实体的菌盖直径、菌盖厚度和菌柄长度相互间存在较大差异。黄灵芝（HLZ）的菌盖直径最大达到（17.42±1.03）cm，其次为圆芝8号，金地灵芝（JD）的菌盖直径最小仅为（8.76±1.20）cm，5个灵芝的菌盖直径相互间存在显著差异（P＜0.05）；黄灵芝和圆芝8号（YZ8）灵芝菌盖厚度较大，二者间不存在显著差异（P＞0.05），金地灵芝的菌盖最薄；在菌柄长度上，金地灵芝和圆芝8号菌柄较长，两者间不存在显著差异（P＞0.05），黄灵芝菌柄最短；圆芝8号的转化率最高达到1.64%，其次为黄灵芝1.58%，最低的为金地灵芝，其转化率为0.64%。从下图1中可以看出，金地灵芝生长整齐度表现一般，有单朵生长也有连芝现象，黄色边缘尚未全部消失就有孢子粉弹出；黄灵芝出芝最晚且稀疏，分支较少，在菌盖生长阶段其边缘为黄色，单朵菌盖直径最大，且菌盖较厚，干产量转化率也较高，综合表现较好；平芝（PZ）菌株出芝最早，成熟时间短，菌盖边缘较平展，分芝较多，菌柄短，产孢量较其他品种多；圆芝8号出芝较整齐，不易分支，色泽较好，成熟时背面为金黄色，子实体外观整齐，单朵菌盖成肾型；灵白（LB）菌株出芝整齐度最差，在菌盖分化阶段，其菌盖边缘为白色，易分支，菌盖厚度较小。综合子实体农艺性状和转化率可以看出圆芝8号菌株表现最好，适合进行推广种植。

2.2 灵芝水提液中活性成分含量比较

从图2中可以看出5个灵芝菌株其子实体多糖含量在1.82%～2.1%之间，PZ最高达到2.1%，YZ8最低为1.82%，HLZ和JD、LB、YZ8存在差异显著（P＜0.05），具体顺序为HLZ＞PZ＞JD＞LB＞YZ8。从图3中可以看出5个灵芝菌株其子实体三萜含量在0.84%～1.06%之间，最高的为JD，其次为PZ，而含量最低的为YZ8，仅为0.84%；JD和PZ两者之间不存在显著差异（P＞0.05），它们与HLZ、LB、YZ8存在显著差异（P＜0.05）。可知，以不同的灵芝菌株通过相同的栽培材料和栽培方法其子实体内活性成分存在较大差异。结果显示，以多糖为目标进行菌株筛选，HLZ为最佳菌株；以三萜为目标进行菌株筛选，JD为最佳菌株。

2.3 不同灵芝子实体抗氧化能力比较

以5个不同灵芝子实体为原料，分析它们的抗氧化能力，对其水提物的DPPH清除率、羟自由基清除率、超氧自由基清除率进行相互比较，以Vc为对照。从图4结果中发现，5个灵芝子实体均具有较强的清除DPPH能力，其清除能力范围在0.945～0.969之间，各菌株之间没有明显的差异（P＞0.05），均与Vc相当。羟自由基清除率结果如图5，清除能力范围在0.234～0.629之间，存在显著差异（P＜0.05），清除能力最强的为HLZ，最低为PZ，JD、HLZ、YZ8这3种灵芝清除羟自由基的能力比Vc强，PZ和LB较Vc弱。从图6超氧自由基清除率结果看出，5种灵芝的清除能力范围在0.455～0.550之间，清除能力都较Vc弱，PZ和YZ8清除能力较强，二者间不存在显著差异，JD、HLZ和LB三者间不存在显著差异（P＞0.05），但与PZ和YZ8存在显著差异（P＜0.05），具体清除率顺序为Vc＞YZ8＞PZ＞HLZ＞LB＞JD。综合得出HLZ和YZ8对自由基的清除能力较JD、PZ和LB强。

图1 段木栽培子实体图Figure 1 Fruiting bodies of cut-log cultivation

图2 不同灵芝菌株其子实体多糖含量Figure 2 Polysaccharide content of different Ganoderma lucidum strains

图3 不同灵芝菌株其子实体三萜含量Figure 3 Triterpenoids content of different Ganoderma lucidum strains

2.4 不同灵芝子实体促进脾细胞增殖作用

5个灵芝子实体为原料，以水提液中多糖浓度为变量，比较分析不同浓度多糖灵芝水提液体外给药对免疫细胞功能的影响。从图7结果中可以看出，JD、HLZ、LB、YZ8其对脾细胞的增殖作用随着浓度的不断提高，脾细胞的增殖先降低后升高，而PZ对脾细胞的增殖作用随着浓度的不断提高，其增殖作用随之提高。HLZ、YZ8在水提液多糖浓度从0.1 mg/mL提高到0.5 mg/mL时，其增殖作用明显增强，LB在水提液多糖浓度为0.05 mg/mL时其增殖作用最强，浓度越高其增殖作用反而变弱了。5个灵芝子实体水提液多糖浓度为0.05 mg/mL时，LB增殖作用最强，PZ最低；水提液多糖浓度为0.10 mg/mL时，其A700值与水体系相当，故其还原能力最弱[11]，5个灵芝菌株子实体的增殖作用相互之间不存在显著差异；水提液多糖浓度为0.50 mg/mL时，HLZ增殖作用最强，PZ最低；JD、HLZ、LB和YZ8这4个灵芝菌株其子实体水提液多糖浓度在0.50 mg/mL和1.00 mg/mL时其脾细胞增殖作用相互间不存在显著差异（P＞0.05），PZ的不同浓度水提液对脾细胞的增殖作用相互间存在显著差异（P＜0.05）。

图4 不同灵芝子实体水提物对DPPH的清除率Figure 4 Scavenging rate of DPPH in aqueous extract of Ganoderma lucidum

图5 不同灵芝子实体水提物对羟自由基的清除率Figure 5 Scavenging rates of hydroxyl radicals from aqueous extracts of different Ganoderma lucidum

图6 不同灵芝子实体水提物对超氧自由基的清除率Figure 6 Scavenging rates of supernatant free radicals from aqueous extracts of different Ganoderma lucidum

图7 不同灵芝子实体水提物浓度对脾细胞的增殖作用Figure 7 Effect of aqueous extract of Ganoderma lucidum on the proliferation of spleen cells

3 讨论与结论

本研究对5种灵芝菌株的子实体农艺性状、转化率、活性成分、抗氧化能力以及对脾细胞的增殖作用进行了分析。

3.1 灵芝子实体农艺性状及转化率分析

目前，市场上栽培的灵芝主要以子实体农艺性状和转化率为依据进行分析[12]，如林兴生等[13]对10个赤芝通过段木栽培模式进行栽培特性分析，发现虽然在分类学名上统称为赤芝然其栽培特性差异较大，其中菌株8、新6产量高，子实体农艺性状较好。王庆武等[14]通过代料栽培模式对17个灵芝菌株进行农艺性状分析，发现各灵芝菌株其芝片形状、芝柄、转化率差异较大，灵芝泰山-4耐二氧化碳适宜做盆景，灵芝P1产量高适合大面积推广。本研究对5个灵芝菌株进行段木栽培，分别从子实体农艺性状和转化率进行分析，发现不同的灵芝菌株其子实体外观形状、色泽、产孢量和出芝整齐度差别较大，如以子实体的农艺性状和干产量转化率为指标，圆芝8号菌株表现最好，较适合推广种植。

3.2 子实体活性成分含量分析

灵芝多糖和三萜类化合物是灵芝的主要活性成分，逐渐成为衡量灵芝品质的一个重要指标[15-16]。有较多学者对不同灵芝的多糖和三萜化合物含量进行研究，周连玉等[17]对8个灵芝菌株通过代料栽培进行子实体产量和多糖含量研究，发现各灵芝子实体产量和多糖含量存在显著差异，并且产量高的菌株其多糖含量不一定高。齐川等[18]通过对11个灵芝子实体活性成分测定分析，结果显示不同灵芝品种子实体均含有较高总多糖和总三萜，然而它们之间的含量均存在显著差异，有的品种其多糖含量较高，但三萜含量却较低，其子实体内多糖和三萜含量不存在协同相关性。付立忠等[19]通过对12个不同灵芝菌株子实体进行多糖和三萜含量分析，发现不同灵芝菌株子实体的多糖和三萜含量存在较大差异。本研究对5个灵芝菌株子实体进行多糖和三萜化合物含量分析，发现不同的灵芝菌株通过相同的栽培材料和栽培方法其子实体内活性成分存在较大差异，多糖含量高的菌株其三萜化合物含量反而低，这一结果与前人研究结果类似。

3.3 子实体活性成分抗氧化能力分析

灵芝的抗氧化作用一直是学术界的热门研究课题，大量研究结果表明灵芝具有较强的抗氧化能力。Pan K.等[20]的研究结果表明灵芝对胃癌大鼠具有免疫调节作用以及抗氧化清除自由基作用，Tie L.等[21]发现灵芝多糖能抑制糖尿病小鼠皮肤的Mn-SOD硝化，增强Mn-SOD和GPX活性，抑制氧化还原酶P66ShC的表达和磷酸化，Jia J.等[22]研究结果显示灵芝多糖能够使大鼠体内抗氧化酶量和胰岛素含量显著升高，同时降低脂质过氧化作用和血糖含量，可见灵芝多糖是一种有效的抗氧化物。聂健等[23]研究7个不同灵芝菌株的热水提取物的体外抗氧化活性，发现各种灵芝子实体热水提取物均有不同程度的体外抗氧化能力，同一浓度下不同灵芝菌株的体外抗氧化能力差异较大。曹正等[24]研究不同灵芝的功能性成分含量和抗氧化活性，发现不同品种间的活性成分含量差异较大，活性成分含量高的菌株其抗氧化能不一定高，同一菌株的活性成分浓度越高其抗氧化能力越高。杨德等[25]研究发现多糖浓度与清除羟基自由基和超氧阴离子的能力呈正相关。张志军等[26]研究表明灵芝具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，且多糖浓度越高其抗氧化能力越强，二者有一定的依赖性；董扬[27]等研究同样表明抗氧化活性与多糖质量浓度呈一定效量关系，多糖质量浓度越高，抗氧化活性越强。本研究对5个灵芝菌株的抗氧化能力进行比较发现，不同的灵芝菌株其抗氧化能力差异较大，这一结果与前人研究相似，5个灵芝菌株的抗氧化能力都很强，总体上HLZ的抗氧化能力最强，YZ8次之。大量研究结果显示灵芝水提液具有很强的抗氧化能力，但其能力强弱并不仅仅由多糖和三萜化合物总含量控制，可能还有很多其他物质共同起作用，这里需要更进一步研究，而且多糖和三萜类化合物的种类、结构、分子量也与其功能密切相关，以至于具体的哪种活性物质起主导作用以及它的作用机制还需要更深一步的研究。

3.4 子实体活性成分增免疫分析

脾脏是动物机体最主要的免疫器官之一，是机体发挥防御功能的重要器官，脾脏指数可作为反映动物机体免疫机能的客观指标之一[28]，灵芝活性物质多糖能显著刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖作用，增强Con A诱导的淋巴细胞增殖。从本研究的试验结果可以看出，5个灵芝子实体活性物质多糖能显著提高脾细胞的增殖作用，多糖浓度越高，脾细胞的增殖作用越强。这一结果与较多学者的研究结果相似，如邹佳妤等[29]研究报道随着多糖浓度的增加脾脏指数也随之增加，二者呈现一定的量效相关性，丁佩娥等[30]研究报道灵芝多糖能显著促进小鼠脾细胞的增殖反应，且在一定范围内呈浓度依赖趋势。这些结果都表明灵芝多糖能促进脾腺的组织分化和细胞增生，促进免疫器官的发育，增加脾腺免疫器官的重量，增大免疫指数。由此可见，灵芝多糖能显著提高机体的免疫力，在一定浓度范围内，多糖浓度越高其免疫力越强。另外，从本研究结果还可以看出不同的灵芝菌株其对脾细胞的增殖作用差距较大，HLZ的增殖作用最强，PZ最低。

目前市场上广泛栽培的灵芝品种非常多，由于灵芝菌种活性退化较快，优质高产菌株筛选一直是育种工作者的重点内容。随着人们消费观念的变化，消费者不再只重视其外观品质而对其药效保健作用更加关注，因而，对如何提高灵芝活性成分的产量成为现在人们致力研究的重点问题。大量研究学者发现不同的灵芝菌株通过相同的栽培原料、相同的栽培方式，其子实体内活性成分含量差异较大，因此，通过筛选出高活性高产量的灵芝菌株成为行之有效的途径之一。