一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3

刘剑 易路遥 晏亮 吉伟佳 虞雪军

文章提出利用一维反相高效液相色譜法测定片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中维生素D的含量。方法：样品经淀粉酶水解，其中加入抗氧化剂；水解后加入氢氧化钾皂化，再用石油醚提取，经氮吹至近干，用甲醇溶解摇匀。经0.22μm有机滤膜过滤后供液相色谱仪分析。以Thermo Accucore Polar Premium（100mm*4.6 mm）为分离柱，甲醇-乙腈为流动相，流速为0.8ml/min，进样量为20μL，在DAD波长264nm处作检测。检出限为0.7μg/100g，方法中维生素D2平均回收率为93.7%- 98.8% ；相对标准偏差0.5%- 5.6%；维生素D3平均回收率为92.8%- 99.1% ；相对标准偏差0.3%- 6.7 %。该方法快速、简便、准确，适用于片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中维生素D测定。

试验部分

仪器与试剂。高效液相色谱仪（美国，型号Ultimate），电子天平（美国，型号XS205DU）、紫外可见分光光度计（日本，型号U- 3900），氮吹仪（美国Orgnomation公司）。

维生素D2（中国食品药品检定研究院）标准品和维生素D3标准品（中国药品生物制品鉴定所）。乙腈、甲醇、2，6-二叔丁基对甲酚、无水乙醇均为色谱纯；石油醚、抗坏血酸、氢氧化钾为分析纯；α-淀粉酶活力300U/mg。

标准溶液配制。标准储备液的制备：精密称取维生素D2标准品11.86mg，置50mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密称取维生素D3标准品12.09mg，置50mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；于4℃条件下储存备用。

标准储备液浓度的校正：精密吸取维生素D2和D3标准储备液各500μl于各10ml棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混匀，分别用1cm比色皿中，以无水乙醇为空白参比，在264nm波长处测定吸光值，得维生素D2储备液浓度为222.4μg/ml和维生素D3储备液浓度为236.8μg/ml。

样品制备。1.酶解：称取混合均匀试样约5g，置250mL三角烧瓶中，加入20ml50℃的水，加入0.01ml单个标准储备溶液作为内标（如测定维生素D2时，把维生素D3作内标；如测定维生素D3时，把维生素D2作内标；）1.0gα-淀粉酶，置于60℃恒温水浴振荡30min。2.皂化：于酶解液中加1.0g抗坏血酸和0.1g2，6-二叔丁基对甲酚，混匀。加入30ml无水乙醇，20ml氢氧化钾溶液（250g氢氧化钾加入250ml水中，冷却后贮存于聚乙烯容器中，临用现配），边加边振摇，混匀后于恒温磁力搅拌器上80℃回流皂化30min，皂化后立即用冷水冷却至室温。3.提取：将皂化液用30ml水转入250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚，振荡提取5min，将下层溶液转移至另一250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚再次提取，合并醚层。用150ml水洗涤醚层，重复4次，将醚层洗至中性，去除下层水相。将洗涤后的醚层于250ml旋转蒸馏瓶中，氮吹至干，用甲醇溶解残渣并定容至10ml，经0.22μm有机滤膜过滤。

仪器工作条件。色谱柱：T he rm o Accucore Polar Premium（100mm*4.6 mm） ，柱温：30℃；DAD检测波长264nm；流速：0.8ml/min；进样量：20μl；流动相：A：乙腈，B甲醇：；梯度洗脱程序：0～8.0min，0%～40%B；8.0～15.0min，40%B；15.0～16.0min，40%～0%B；16～20min，0%B。

结果与讨论

样品制备方法的选择。为使维生素D2、维生素D3得到良好的提取效果，试验中还采用了甲醇和乙腈直接提取的处理方法。如下：取2.5g样品置25ml容量瓶中，分别加入甲醇和乙腈溶液，超声30min，冷却至室温，分别用甲醇和乙腈定容，摇匀；经0.22μm有机滤膜过滤。经仪器检测发现以上两种处理方法出效果不佳，样品量远远未得到有效提取，得不到理想的处理效果；采用先酶解，在皂化，最后提取的处理方法能有效检测样品中的维生素D的含量。试验选择酶解，在皂化，最后提取的处理方法。

流动相的选择。试验采用了甲醇、乙腈、甲醇-水（50+50）、乙腈-水（50+50）和甲醇-乙腈（梯度洗脱程序：0～8.0min，0%～40% B；8.0～15.0min，40% B；15.0～16.0min，40%～0% B；16～20min，0% B。）为流动相，试验发现当采用甲醇-乙腈（梯度洗脱）使维生素D2和维生素D3良好的分离效果，分离度在2.0以上，符合检测要求，试验选择甲醇-乙腈（梯度洗脱程序：0～8.0min，0%～40% B；8.0～15.0min，40%B；15.0～16.0min，40%～0%B；16～20min，0%B。）为流动相。

标准曲线和检出限。精密吸取维生素D2标准储备液各0ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml于100ml棕色容量瓶中，分别加入0.1ml维生素D3标准储备液作为内标，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得维生素D2系列标准曲线溶液。精密吸取维生素D3标准储备液各0ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml于100ml棕色容量瓶中，分别加入0.1ml维生素D2标准储备液作为内标，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得维生素D3系列标准曲线溶液。精密吸取系列标准溶液20μl注入液相色谱仪检测，记录色谱图，以标准曲线浓度为横坐标，以标准物质峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，维生素D2、维生素D3标准曲线溶液浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系；

维生素D2标准曲线为：

y=0.4136x- 0.0026，R2=0.9999；

维生素D3标准曲线为：

y=0.6176x- 0.0049，R2=0.9999。

按所建立的色谱条件，以3倍噪音比作为本方法检出限、10倍信噪比为定量限，测得维生素D2、维生素D3的检出限均可以达到 0.7μg/100g，定量限均可以达到2μg/100g。维生素D2、维生素D3色谱图见图1。

方法的回收率和精密度。分别在片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中添加维生素D2、维生素D3标准储备液，考察方法的回收率。每个样品重复测定6次，考察方法的精密度，结果样品的维生素D2平均回收率为93.7% -98.8% ；相对标准偏差0.5%- 5.6 %；样品的维生素D3平均回收率为92.8%- 99.1% ；相对标准偏差0.3%- 6.7 %；方法准确度及精密度满足要求。

本法将片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健品样品，经酶解、皂化、提取后，采用一维反相液相色谱条件下检测，得到良好的分离。本法前处理简单，分离度好，回收率高，分析速度快，精密度好，准确度高等优点。能够用于片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中的维生素D测定。

作者简介：

刘剑（1990-），男，本科学历，助理工程师，主要从事食品药品化妆品检验研究。通讯作者：易路遥（1983-），女，硕士学历，质量高级工程师，主要从事食品药品化妆品检验研究。