硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠的抗肿瘤作用研究

薛玲 刘祥东 付思雨 李震 罗晓庆

摘要：目的  探究硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞转化率及SBP-1表达的影响，分析硒多糖对乳腺癌小鼠的抑瘤效果及作用机制。方法  将40只小鼠随机分为4组，每组10只，其中1組作为正常组，其余3组将MCF-7乳腺癌细胞悬液注射于小鼠左侧膈腧穴处建立乳腺癌模型，证明成瘤后予以给药，模型组（予等剂量的生理盐水），硒多糖用药组（400 mg/kg硒多糖）、联合用药组（50 mg/kg环磷酰胺+400 mg/kg硒多糖），连续给药14 d。脱颈处死小鼠，测胸腺指数、脾指数，无菌条件下取脾脏研磨进行体外淋巴细胞培养，检测PHA诱导下的小鼠脾淋巴细胞转化率并应用免疫组化技术检测肿瘤组织中SBP-1的表达情况。结果  与正常组和模型组相比较硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数、脾指数及淋巴细胞转化率明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与硒多糖用药组比较联合用药组的胸腺指数、脾指数及淋巴细胞转化率均有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比硒多糖用药组及联合用药组的SBP-1蛋白表达均有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与硒多糖用药组相比联合用药组的SBP-1蛋白表达有所增强，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  硒多糖可以通过改善MCF-7乳腺癌小鼠的免疫功能及增强SBP-1的表达来起到抗肿瘤作用，与环磷酰胺联合用药作用更显著。

关键词：硒多糖;抗肿瘤;乳腺癌;SBP-1蛋白

中图分类号：R737.9                                   文献标识码：A                               DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.024

文章编号：1006-1959（2019）01-0073-04

Anti-tumor Effect of Selenium Polysaccharide on MCF-7 Breast Cancer Mice

XUE Ling，LIU Xiang-dong，FU Si-yu，LI Zhen，LUO Xiao-qing

（Qiqihar Medical College，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

Abstract：Objective  To investigate the effects of selenium polysaccharide on spleen index， thymus index， spleen lymphocyte transformation rate and SBP-1 expression in MCF-7 breast cancer mice， and to analyze the anti-tumor effect and mechanism of selenium polysaccharide on breast cancer mice. Methods  40 mice were randomly divided into 4 groups， 10 in each group， 1 of which was used as the normal group. The other 3 groups were injected with MCF-7 breast cancer cell suspension into the left axillary cavity of mice to establish a breast cancer model. It was proved to be administered after tumor formation， model group （administered with equal dose of normal saline）， selenium polysaccharide treatment group （400 mg/kg selenosaccharide）， and combination group （50 mg/kg cyclophosphamide + 400 mg/kg selenosaccharide） ， continuous administration for 14 d. The mice were killed， thymus index and spleen index were measured， spleen was ground to culture lymphocytes in vitro under aseptic condition. The transformation rate of spleen lymphocytes induced by PHA and the expression of SBP-1 in tumor tissues were detected by immunohistochemistry.Results  Compared with the normal group and the model group， the thymus index， spleen index and lymphocyte transformation rate of the selenopolysaccharide group and the combination group were significantly increased （P<0.05）; compared with the selenopolysaccharide group. The thymus index， spleen index and lymphocyte transformation rate of the group were increased， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， the SBP-1 protein expression in the selenopolysaccharide group and the combination group was compared，the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the selenium polysaccharide group， the expression of SBP-1 protein was enhanced，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  Selenium polysaccharide can play an anti-tumor effect by improving the immune function of MCF-7 breast cancer mice and enhancing the expression of SBP-1. The combination with cyclophosphamide is more significant.

Key words：Selenium polysaccharide;Anti-tumor;Breast cancer;SBP-1 protein

乳腺癌（breast cancer）是女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前，西医针对乳腺癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等，无论是肿瘤本身还是各种治疗手段均会给患者的生活和工作造成严重影响[2]。乳腺癌的发病率高，危害大，日益受到研究者的广泛关注。硒是机体生理活动必需的微量元素之一，在提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤方面均发挥着重要作用[3]。硒多糖作为一种有机硒化合物，既保持了多糖较高的生物利用率又具有硒的生物功能，对生物体的毒性大大降低，且活性明显高于硒和多糖[4]。硒多糖具有调节健康小鼠免疫功能的作用[5]，但硒多糖能够抑制乳腺癌细胞增殖的机制未见详细报道。硒结合蛋白1（selenium binding protein，SBP-1）是体内硒结合蛋白的一种，较正常组织相比，SBP-1在肿瘤组织中表达减少[6，7]。研究表明，SBP-1的表达增高有助于增强机体的抗癌能力，SBP-1可以成为乳腺癌的临床诊断和预后判断的指标[8]。本研究通过探讨硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠胸腺指数、脾指数、淋巴细胞转化率及SBP-1表达的影响，进一步探明硒多糖调节荷瘤机体免疫功能及抗肿瘤的机制，从而对硒多糖抗乳腺癌作用的相关性进行研究，为肿瘤的预防及免疫治疗提供新方向。

1材料与方法

1.1实验动物  健康的雌性BALB/c小鼠40只，普通级，4～6周龄，体质量18～20 g，均由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供，本实验已经动物伦理委员会批准研究。

1.2主要试剂  MCF-7乳腺癌细胞株（由齐齐哈尔医学院医药研究所惠赠）;RPMI1640完全培养基（购自美国Gibco）;胎牛血清（购自杭州四季青生物公司）;红细胞裂解液（购自Biosharp）;MTT、二甲基亚砜（购自北京索莱宝生物公司）;硒多糖（购自湖北天夏生物工程有限公司）;环磷酰胺（购自通化茂祥制药有限公司）;SBP1抗体（购自上海康朗生物科技有限公司）;免疫组化试剂盒（购自福州迈新）。

1.3主要仪器  电子天平;倒置相差显微镜;超净工作台;离心机;CO2恒温培养箱;恒温水浴箱;高压锅;超低温冰箱（-80%）;酶標仪;石蜡切片机;光学显微镜。

1.4方法

1.4.1动物分组  按体重进行蛇形分组，随机分为4组：正常组、模型组、硒多糖用药组、联合用药组，每组10只。

1.4.2造模  将MCF-7乳腺癌细胞传代培养，取生长良好的细胞，将细胞浓度调整至1×107个/ml，按0.1 ml/只于除正常组外其他3组小鼠的左侧膈腧穴处进行注射接种，从而建立小鼠乳腺癌模型[9，10]，正常组不建立乳腺癌模型。15 d后在可触及皮下肿瘤时证明已完成乳腺癌模型种植。

1.4.3给药  硒多糖用药组以400 mg/kg的硒多糖剂量予以给药[5];联合用药组以50 mg/kg的环磷酰胺，1次/2 d[11]以及400 mg/kg的硒多糖予以给药;模型组予以等剂量的生理盐水;正常组不予任何药物处理，给药方式均为灌胃给药，连续给药14 d。

1.4.4测胸腺指数、脾指数  用药结束后，用电子天平分别测量单只小鼠的体质量，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠的胸腺、脾脏，计算胸腺指数、脾指数。

1.4.5检测小鼠脾淋巴细胞转化率  取无菌脾脏研磨进行体外淋巴细胞培养，制成单个细胞悬液，将细胞浓度调整为3×106个/ml，并加入24孔培养板中（每孔1 ml），将其分为实验组（每孔加50 μl PHA液）和对照组（不加PHA），置5% CO2，37 ℃培养箱中培养68 h。取出，每孔吸去上清液0.7 ml，随后加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI1640培养液及5 mg/ml的MTT 50 μl/孔，继续置5% CO2，37 ℃培养箱中培养4 h。取出，加入二甲亚砜1 ml/孔，然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶标仪在570 nm波长下测定光密度（OD）值。

1.4.6检测肿瘤组织中SBP-1的表达  取模型组、硒多糖用药组、联合用药组的肿瘤组织于10%甲醛溶液中固定，梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、常规石蜡包埋、切片机切片、烤片、脱蜡、高压法修复抗原，应用Envision免疫组化试剂盒对切片进行染色，并滴加DAB显色剂显色，镜下控制显色时间并用自来水终止显色。随后用苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察各组肿瘤组织中SBP-1的表达情况，并应用Image-Pro Plus软件进行图片数据分析。

1.5统计学方法  实验数据用SPSS 20.0统计学软件进行分析，以（x±s）表示，组间比较用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠胸腺指数、脾指数的比较  与正常组相比硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数与脾指数均有所增高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的胸腺指数与脾指数亦有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与硒多糖用药组相比联合用药组的胸腺指数、脾指数均有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）。说明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，与CTX联合用药可以起到增效减毒的作用。见表1。

2.2各组小鼠淋巴细胞转化率比较  与正常组相比硒多糖用药组、联合用药组的脾淋巴细胞转化率均有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的脾淋巴细胞转化率亦有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与硒多糖用药组相比联合用药组的脾淋巴细胞转化率明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）。说明硒多糖可以改善乳腺癌小鼠的免疫功能，与CTX联合用药可以起到增效减毒的作用。见表2。

2.3肿瘤组织中SBP-1的表达情况  应用Image-Pro Plus软件分别对模型组、硒多糖用药组、联合用药组SBP-1的表达情况进行检测，结果用平均光密度值（Mean of IOD）表示。SBP-1蛋白表达于细胞的胞浆和胞核，呈棕黄色颗粒（图1～图3）：与模型组相比硒多糖用药组、联合用药组的SBP-1表达有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）;与硒多糖用药组相比联合用药组的SBP-1表达亦有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）。说明硒多糖可以通过增强SBP-1的表达来起到抗肿瘤作用，与CTX联合用药作用更显著。见表3。

3讨论

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是危害女性健康的常见疾病，其发病率、死亡率均位居前列[12]。乳腺癌的发生主要与内分泌激素功能紊乱、遗传因素、生育哺乳及营养因素等有关。目前针对乳腺癌的治疗方法主要有手术治疗、内分泌治疗、化学药物治疗、放射治疗、分子靶向治疗等，其中化疗已成为乳腺癌病程各期的积极治疗措施[13，14]。乳腺癌虽对化疗药物敏感，但在许多研究中发现其并未有效提高患者生存率[15]，目前我们针对乳腺癌化疗药物的认知仍不全面，还有待进一步研究。

环磷酰胺作为一种广谱的抗肿瘤药物，在乳腺癌的治疗中发挥着重要作用[16]。硒多糖作为一种安全有效的免疫调节剂，具有多种生物活性，毒副作用小，拥有不可估量的研究价值[17]。本文通过对BALB/c小鼠建立乳腺癌模型，测定小鼠的脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞转化率及腫瘤组织中SBP-1的表达情况，从细胞免疫及肿瘤组织中SBP-1的表达方面探讨了硒多糖对MCF-7乳腺癌小鼠的抑瘤作用机制。但本实验仅检测了乳腺癌小鼠的脾淋巴细胞转化率及SBP-1的表达，今后我们还会进一步检测乳腺癌小鼠的脾NK细胞活性及抗体积数，探讨硒多糖是否通过提高细胞免疫、体液免疫功能及增强NK细胞的杀伤活性来增强荷瘤机体的免疫力，为肿瘤的预防和免疫治疗提供新方向。

通过对各组乳腺癌小鼠胸腺指数、脾指数的比较表明，硒多糖用药组及联合用药组的脾指数及胸腺指数均有所提高，且相比较硒多糖用药组联合用药组效果更显著，差异有统计学意义（P<0.05）;通过对各组脾淋巴细胞转化率的比较表明，硒多糖用药组及联合用药组的脾淋巴细胞转化率均有所提高，且相比于硒多糖用药组联合用药组效果更显著，差异有统计学意义（P<0.05）;通过对各组肿瘤组织中SBP-1表达情况的分析表明，硒多糖用药组及联合用药组SBP-1的表达均有所增强，相比较硒多糖用药组联合用药组的效果更显著，差异有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明，硒多糖可以提高乳腺癌小鼠的脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞转化率及SBP-1的表达从而起到抑瘤作用，在与环磷酰胺联合用药时效果更显著。

综上所述，硒多糖可以提高乳腺癌小鼠的脾指数、胸腺指数及脾淋巴细胞转化率，从而在一定程度上增强乳腺癌小鼠的免疫功能，还可以通过诱导SBP-1的表达起到抗肿瘤作用，其与环磷酰胺联合用药时作用更显著，抗肿瘤效果更明显。

参考文献：

[1]周洁，陈萱，陈钰，等.三阴性乳腺癌的治疗现状及进展[J].医学研究生学报，2018，31（08）：853-858.

[2]高山.早期乳腺癌保留乳腺手术治疗的疗效分析[J].中国现代药物应用，2016，10（05）：59-60.

[3]Kieliszek M，Blazejak S.Current knowledge on the importance of selenium in food for living organisms： a review[J].Molecules，2016，21（5）：609.

[4]Sun Q，Dong M，Wang Z，et al.Selenium-enriched polysaccharides from Pyracantha （Se-PFPs） inhibit the growth and invasive potential of ovarian cancer cells through inhibitingβ-catenin signaling [J].Oncotarget，2016，7（19）：28369-28383.

[5]李岩，霍娇，吕晓华，等.硒多糖对小鼠免疫功能的影响[J].四川大学学报，2014，45（3）：512-514.

[6]孙美娜，赵汉东，张一彤，等.饮食低硒对小鼠肝、肾、脑组织硒结合蛋白1与硒蛋白P表达的影响[J].中华地方病学杂志，2013，32（06）：636-638.

[7]杨子荣，刘城，张孟，等.硒结合蛋白1在肝癌中的表达及其临床意义[J].中国实验诊断学，2018，22（06）：1078-1080.

[8]刘杰文.硒结合蛋白1在乳腺癌中的表达及意义[D].山西医科大学，2009.

[9]周跃华，殷东风.利用骨髓穿刺针建立MCF-7乳腺癌裸鼠原位移植模型[J].中国中医基础杂志，2013，19（5）：535-536.

[10]赵大蔚.薯蓣丸对乳腺癌小鼠免疫功能影响的实验研究[D].贵州医科大学，2016.

[11]迟淑萍，白冰柯，谢进，等.环磷酰胺在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制的研究[J].中国医药导报，2012，33（14）：20-22.

[12]蒋析文，刘悦，朱小亚，等.BRCA基因突变型乳腺癌研究进展[J].生物产业技术，2018（02）：43-49.

[13]Li C，Li L.Progress in drug treatment of triple -negative breast cancer[J].Journal of Modern Oncology，2016，24（21）：3505-3508.

[14]罗年安，屈亚琦，董瑞.乳腺癌的治疗进展[J].现代生物医学进展，2015，15（1）：160-162，166.

[15]肖宝强，史雪婧.三阴性乳腺癌治疗的研究现状与进展[J].医学理论与实践，2018，31（09）：1286-1288.

[16]Yao L，Chen L，Zhang K，et al.Clinical efficacy of cyclophosphamide beats chemotherapy in treating TNBC[J].Journal of Modern Oncology，2018，26（18）：2875-2877.

[17]梁欢，黄进，王丽，等.药用植物硒多糖的研究进展[J].中国中药杂志，2018，43（15）：3080-3092.