漆树漆酶的提取分离及性质研究

尤俊昊，黄晓华，赵爱国

(西北农林科技大学林业科学研究院，陕西 杨凌 712100)

我国是世界上漆树资源最丰富的国家,在我国大部分省(区)均有分布。生漆是漆树次生代谢产物，是从漆树中分泌出的一种灰白色浊液，为优良的天然涂料，具有抗腐蚀、防潮、耐高温、防水等优点，在我国已有6 900多年的应用历史[1-2]，长久以来享有“涂料之王”的美誉[3]。生漆主要由漆酚、漆酶、树胶质和水组成，其中催化生漆干燥成膜的重要物质是生漆中所含的漆酶[4]，漆树漆酶是生漆的重要组成部分，漆树漆酶是催化漆酚聚合成膜的主要成分，在生漆精制及改性过程中漆树漆酶容易失去活性。因此，对漆树漆酶进行分离提取，并确定其性质，不仅对漆树漆酶的研究、开发、利用具有重要的意义，而且对生漆改性精制也有非常重要的意义。

对漆酶的研究已有100多年的历史,是有记载以来开发最早的酶之一。1883年,漆树漆酶最早由日本人吉田从日本漆树(Toxicodendronvernicifluum)的汁液中分离，当时被误为淀粉酶物质[5]。1898年，法国人Bertrand对这种淀粉酶类物质的催化活性进行了分析，并重新命名为漆酶(Laccase)[5]。Reinhammar等和杜予民等对漆酶及漆树液全成分的分离纯化作了很好的工作;另外,熊野等对漆酶反应机理,黄葆同和甘景镐等对中国漆酶化学的发展, Morpurgo等对漆酶铜原子中心的研究作出了各自的贡献[6]。漆酶(EC1.10.3.2)，全称为对-二酚∶(双)氧氧化还原酶，又称为酚酶、漆酚氧化酶等，是一种含铜的糖蛋白氧化酶，能催化酚、硫酚和芳胺等物质的氧化反应，属于铜蓝氧化酶蛋白家族的一员[7]。

漆酶在真菌、植物、原核生物中均有发现。它能催化多酚、多胺基苯等底物氧化。多年来, 漆酶的研究经久不衰, 它涉及生物、化学、环境等多个学科领域, 一直引起人们的广泛关注和极大兴趣[8-14]。漆酶对漆酚的聚合、纸浆去木质素、高等植物病菌防御等过程也起着重要的作用，近年来已经广泛用于药物分析、乙醇生产和酒类去酚、生物整治(包括染料脱色、工业废水处理和杀虫剂的降解)等领域[3,15]。漆酶酶活的测定方法很多，有分光光度法、测O2法、高效液相色谱法、极谱法、脉冲激光光声分析法、微量热法等[16]。由于漆酶的来源很多，而不同来源的漆酶与底物反应的亲和力是不一样的，即使是同一来源的漆酶，反应的底物不同，反应的亲和力也不同，测得的酶活数值也不同。所以，至今还没一种标准的、统一的酶活测定方法。漆树漆酶反应条件温和、具有很宽的底物选择性[17-18]。如今，ABTS法是目前研究中最常用的漆酶酶活测定方法之一，本研究涉及了温度、pH、金属离子种类及浓度对漆树漆酶活性的影响，以确定ABTS法测定灵芝漆酶酶活的最适条件。

1 材料与仪器

1.1 材料

精滤生漆(标准生漆)，陕西卓萌商贸有限责任公司。

1.2 主要试剂与仪器

2,2′-连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(简称ABTS)为美国SIGMA公司产品，柠檬酸、磷酸氢二钠、硫酸铵、硝酸钙、七水合硫酸锌、五水合硫酸铜、六水合三氯化铁、氯化钾、硫酸镍等试剂均为国产分析纯试剂。

主要仪器有：尤尼柯(上海)UV2600A型紫外可见分光光度计；北京科伟永兴仪器HH-1型电热恒温水浴锅；上海亚荣生化SHZ-Ⅲ型循环水真空泵；湖南湘仪离心机；北京君意电泳仪；上海良平FA1004电子天平。

1.3 漆树漆酶的提取分离

漆树漆酶粗提：将500 g生漆原料倒于2 000 ml大烧杯中，加2～3倍冷丙酮搅拌置于0 ℃左右环境静置4 h。静置分层，将上层清液倒出，下层沉降进行负压抽滤，用冷丙酮冲洗沉淀至滤液无色,然后收集沉淀即得丙酮粉末粗漆酶，将其置于通风橱风干。将所得风干好的滤饼粉末倒入提前准备好的500 ml溶液中进行磁力搅拌2～3 h。将搅拌后的液体进行离心操作，再进行负压抽滤，所得滤饼颜色呈蓝灰色。

漆树漆酶精提：将提取的粗漆酶溶解在一定量的含10%(NH4)2SO4的pH为6.8浓度为50 mmol·L-1的Tris-HCL缓冲溶液中进行沉淀操作，盐沉后现象并不明显。再向滤液中加入丙酮，静置后分层，上层为絮状物，将上层分离，下层溶液再次负压抽滤，将抽滤后的滤液装入离心管内再次离心，得到浅蓝色滤液，漆树漆酶精提成功。

1.4 漆树漆酶测定方法

ABTS法测定漆酶酶活：向试管中加入1 ml缓冲溶液，0.5 ml的0.25 mmol·L-1的ABTS，摇匀，加入5 μl稀释了适当倍数的漆树漆酶溶液，测定420 nm处6 min时的吸光值。每个测定条件设3个平行，结果数据为平均值。

漆树漆酶酶活定义：每分钟氧化1 μmol底物所需要的酶量为1个酶活单位(U)。

漆树漆酶酶活计算公式：

式中ε为ABTS吸光系数360 000 L(mol·cm)-1，V总代表漆树漆酶酶活测定反应体体系中的体积，V酶代表反应添加的酶液体积。

2 结果与分析

2.1 漆树漆酶提取结果

将提取到的漆酶进行SDS-PAGE凝胶电泳后，结果如图1所示，左边两条为漆树漆酶蛋白条带，最右侧为标准蛋白Marker蛋白条带。如图结果所示，漆树漆酶显示一条明显的蛋白条带，比对漆树漆酶蛋白和标准蛋白Marker在电泳凝胶上的相对迁移率，得知该漆树漆酶蛋白条带相对宽广，其分子量约为100 KDa左右。根据漆树漆酶氨基酸序列预测，去掉信号肽，其分子量约为55 KDa，但由于漆酶有翻译后糖基化修饰，漆树漆酶中含糖量高达45%，故漆酶成熟蛋白分子量要大于根据氨基酸序列预测所得分子量，此结果与所报道的大多数的漆树漆酶的分子量大致相同[19]。

图1 漆树漆酶蛋白凝胶电泳图

2.2 pH对漆树漆酶活性的影响

分别以pH2.2的氯化钾-盐酸缓冲液和pH2.6～5.4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配制漆树漆酶反应液于室温(25 ℃)反应6 min后测定漆酶酶活，结果见图2。

图2 pH值对漆树漆酶活性的影响

由图2结果表明：不同pH的缓冲溶液对漆树漆酶活性有着不同的影响，在pH为3左右范围内漆树漆酶活性较高，其中pH为2.6时漆酶活性最高，漆树漆酶活力为641.67 U·L-1。在pH大约为4以后，漆酶活性较低，缓冲溶液对漆酶活性影响较不明显。

2.3 温度对漆树漆酶活性的影响

将pH为2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配置漆树漆酶反应液于25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃保温反应6 min后测定漆酶酶活。结果见图3。

图3 温度对漆树漆酶活性的影响

由图3结果表明：漆树漆酶的活性在35 ℃时最高，即漆树漆酶的最适温度为35 ℃，漆酶活力为720.833 U·L-1。当温度从25 ℃到35 ℃过程中，漆树漆酶的活性随温度的升高而增加，35 ℃时达到峰值，漆树漆酶活性最大。当温度高于35 ℃时漆树漆酶的活性整体呈下降趋势，45～55 ℃之间漆树漆酶活性趋于平稳，变化不明显，当温度高于55 ℃时漆酶活性急剧下降。由此表明影响漆树漆酶的最适温度为35 ℃，这与张飞龙[20]所报道的漆树漆酶最适温度相一致。

2.3 金属离子对漆树漆酶活性的影响

将pH为2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配置漆树漆酶添加金属离子溶液置于35 ℃保温反应6 min后测定漆酶酶活。

分别配制金属离子终浓度为0、3、5、7、10、50、100 mmol·L-1的含有铜和金属离子终浓度为0、5、10、50、100、200、300 mmol·L-1的镍金属离子的漆树漆酶溶液来测定铜、镍金属离子对漆树漆酶酶活影响。其中结果(图4和图5)表明，铜、镍两种金属离子在低浓度(即0～10 mmol·L-1)时对漆树漆酶活性有激活作用，大致在0～10 mmol·L-1起强激活作用，其中铜离子激活作用最强，这与报道的漆酶是一种含铜的多酚氧化酶相一致(Palmieri G et al. 1999)。随后激活作用下降；在高浓度时(10 mmol·L-1后)对漆树漆酶活性起抑制作用。且在10 mmol·L-1后金属离子对漆树漆酶酶活的抑制近似趋于饱和状态，即金属离子浓度对漆树漆酶活性影响不再突出。

图4 Cu2+对漆树漆酶活性的影响

图5 Ni2+对漆树漆酶活性的影响

配制金属离子终浓度为0、5、7、9、10、12 mmol·L-1的含有三价铁金属离子的漆树漆酶溶液来测定Fe3+对漆树漆酶酶活影响。其中结果(图6)表明，Fe3+在低浓度时就对漆树漆酶活性有强抑制作用，这与所报道中漆酶受Fe3+强抑制作用相一致(王国栋等 2003)。大致在0～10 mmol·L-1起强抑制作用；在较高浓度(10 mmol·L-1后)对漆树漆酶活性抑制作用近似饱和，漆树漆酶活性趋近于0。

图6 Fe3+对漆树漆酶活性的影响

分别配制金属离子终浓度为0、3、5、7、10、50、100 mmol·L-1的含有钙、锌、钾三种金属离子的漆树漆酶溶液来测定三种金属离子对漆树漆酶酶活影响。其中结果(图7-9)表明，三种金属离子在低浓度时对漆树漆酶活性影响不大，大致在0～10 mmol·L-1起微弱的激活作用；在高浓度时(10mmol·L-1后)对漆树漆酶活性起抑制作用。且均在10 mmol·L-1后金属离子对漆树漆酶酶活的抑制近似趋于饱和状态，即金属离子浓度对漆树漆酶活性影响不再突出。

图7 Ca2+对漆树漆酶活性的影响

图8 Zn2+对漆树漆酶活性的影响

图9 K+对漆树漆酶活性的影响

3 结论

(1)以生漆为原料，通过冷丙酮和硫酸铵提取成功获得漆树漆酶溶液，经凝胶电泳测得漆树漆酶蛋白大小约在100 KDa左右，根据漆树漆酶氨基酸序列预测，去掉信号肽，其分子量约为55 KDa，经BSA标准溶液做标准曲线测得所提取漆树漆酶蛋白溶液浓度为386.933 μg·L-1。

(2)当pH为2.6时漆树漆酶活性最高，漆树漆酶活力为641.67 U·L-1。在pH大约为4以后缓冲溶液对漆酶活性影响较不明显。在pH为2.6条件下漆树漆酶的的最适温度为35 ℃，漆酶活力为720.833 U·L-1。

(3)在低浓度时，铜、镍离子对漆树漆酶酶活起激活作用，其中铜离子激活作用最强；三价铁离子对漆树漆酶酶活起强抑制作用；钙、锌、钾离子对漆树漆酶酶活影响不显著；在高浓度时，各金属离子均不同程度抑制漆酶酶活，对漆树漆酶活性抑制作用近似饱和，金属离子浓度对漆树漆酶活性影响不再突出。